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Tesi etd-07012015-113700


Thesis type
Tesi di specializzazione (5 anni)
Author
PIRAS, MARTINA
URN
etd-07012015-113700
Title
La discinesia ciliare primaria: aspetti microbiologici e nuove prospettive terapeutiche
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA
Commissione
relatore Dott. Pifferi, Massimo
relatore Prof. Pistello, Mauro
Parole chiave
  • Gene editing
  • Discinesia ciliare primaria
  • Infezioni betteriche
Data inizio appello
24/07/2015;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
24/07/2018
Riassunto analitico
La discinesia ciliare primaria (DCP) è una malattia genetica eterogenea rara (1:15.000-20.000) a decorso cronico. Ciò che la caratterizza è la ridotta clearance mucociliare conseguente all’alterazione del movimento e della frequenza delle ciglia che ricoprono l’epitelio delle vie respiratorie, cui fanno seguito infezioni ricorrenti e recidivanti che, nel tempo, inducono il declino della funzione polmonare. Il trattamento di questa condizione è, ad oggi, esclusivamente volto al controllo, mediante terapia antibiotica, delle infezioni a carico dell’apparato respiratorio.<br>Questo lavoro di tesi si sviluppa con un’analisi della prevalenza delle infezioni batteriche nei soggetti affetti da DCP, rispetto ad una popolazione con malattia cronica polmonare, cui la diagnosi di DCP è stata esclusa. Successivamente è stata valutata l’influenza delle infezioni sul decorso della patologia polmonare. In seguito tratta lo sviluppo di un nuovo approccio per il ripristino dell’attività ciliare mediante terapia genica. <br>Negli ultimi quattro anni, i soggetti afferenti alla Sezione di Pneumologia e Allergologia della Clinica Pediatrica dell’Azienda Ospedaliero - Universitaria Pisana per eseguire i test diagnostici relativi alla diagnosi di DCP e il successivo follow-up, sono stati sottoposti ad esame colturale dell’espettorato e ai controlli di funzionalità respiratoria. Da ciò è emerso che il microrganismo a maggiore prevalenza nella DCP è P. aeruginosa, seguito da S. aureus e H. influenzae. Inoltre, P. aeruginosa, mostra una percentuale di isolamento crescente all’aumentare dell’età ed alla gravità della malattia. Al contrario la percentuale di isolamento di S. aureus decresce con l’età.<br>Infine, per lo sviluppo di un nuovo sistema di correzione del battito ciliare, sono stati selezionati due pazienti portatori di mutazioni a carico del gene DNAH11 che codifica componenti essenziali al corretto battito ciliare. Le colture cellulari, prelevate tramite brushing nasale di epitelio ciliato, sono state trasdotte con vettori lentivirali per veicolare nelle cellule le proteine TALEN (transcription activator-like effector nucleases) per operare il taglio specifico del DNA a livello della sequenza mutata, e il frammento di DNA per la ricombinazione sito specifica (Rec). L’avvenuta sostituzione della sequenza mutata con quella wild-type si è esplicata nella normalizzazione della frequenza e della morfologia del battito ciliare in circa il 25% delle cellule: prima della trasduzione le cellule presentavano un battito ciliare rigido ed ipercinetico (18-22 Hz), dopo la trasduzione era osservabile un battito ciliare a frusta con una frequenza pari a 13 Hz. <br>Oggigiorno il cardine della terapia nella DCP è rappresentato da cicli ripetuti di antibiotici volti alla eradicazione delle infezioni polmonari. In un’epoca in cui lo sviluppo delle resistenze agli antibiotici da parte dei batteri, è rapido e preoccupante, questo sistema di correzione del battito ciliare si pone, in futuro, come una valida alternativa.<br><br><br>Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a genetic heterogeneous rare disease (1: 15,000-20,000) with a chronic course. What characterizes it is the reduced mucociliary clearance which results from the alteration of the movement and the frequency of cilia that cover the epithelium of the respiratory tract, thus allowing the recurrence of infections, which, over time, cause the decline in lung function. To date the treatment consists only in the control, with antibiotic therapy, of infections of the respiratory apparatus.<br>This thesis develops an analysis of the prevalence of bacterial infections in patients with PCD, compared to a population with chronic lung disease to whom the diagnosis of DCP was excluded. Subsequently, it evaluate the influence of infections on the course of lung disease. Following is the development of a new approach for restoring ciliary activity by gene therapy.<br>Over the last four years, subjects referring to the Section of Pulmonary and Allergy of the Pediatric Clinic of the University Hospital of Pisa to undergo the diagnostic tests related to the diagnosis of PCD and the subsequent follow-up, underwent sputum culture, and control of respiratory function. From this it emerged that the most prevalent microorganism in PCD is P. aeruginosa, followed by S. aureus and H. influenzae. Furthermore, P. aeruginosa, shows a growing percentage of isolation with increasing age and the severity of the disease. In contrast, the isolation rate of S. aureus decreases with age.<br>Finally, for the development of a new system of correction of the ciliary beat, we have selected two patients carrying mutations in the DNAH11 gene that encodes essential components to a correct ciliary beat. Cultures of cells, harvested by nasal brushing of the ciliated epithelium, were transduced with lentiviral vectors to carry in the cells: TALEN proteins (transcription activator-like effector nucleases) which are designed to cleave a specific DNA sequence; and the DNA fragment for the site specific recombination (Rec). By means of the normalization of the frequency and morphology of ciliary beat pattern in about 25% of the cells, we can state that the mutated sequence has been replaced with the wild-type: before transduction the cells showed a stiff and hyperkinetic ciliary beat pattern (18-22 Hz), after the transduction was observed a normal ciliary beat and frequency pattern equal to 13 Hz.<br>Today the mainstay of therapy in the DCP is represented by repeated courses of antibiotics aimed at the eradication of lung infections. At a time when the development of antibiotic resistance by bacteria, is rapid and worrying, this correction system ciliary beat arises in the future as a viable alternative.<br>
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