• Jhdm1D; Kdm7a; Xenopus laevis; istone demetilasi

Il gene jhdm1D (anche noto come KIAA1718 e KDM7A) codifica per una lisina demetilasi istonica, appertenente alle famiglia jumonji. Le funzioni e il ruolo di Jhdm1D nello sviluppo sono state solo recentemente prese in esame e non sono state ancora del tutto chiarite. Jhdm1D è stata dimostrata essere in grado di rimuovere i gruppi metile dalla lisina 9 e 27 dimetilate (H3K9me2, H3K27me2), riconosciuti come markers di repressione della trascrizione genica, e studi condotti in vitro e in vivo hanno messo in evidenza che è in grado di promuovere il differenziamento neurale attraverso il fattore di crescita FGF4.
In questo progetto di tesi, è stata innanzitutto approfondita l’analisi dell’espressione in embrioni di Xenopus laevis mediante ibridazione in situ. Dal seguente studio è emerso che l’RNA messaggero è presente già in fase precoce, localizzato nei blastomeri dell’emisfero animale nelle fasi di segmentazione, facendo ipotizzare che si tratti di un trascritto materno. A stadio di blastula e successivamente di gastrula la sua espressione è localizzata nella involuting marginal zone (IMZ). Lo stadio di neurula mostra una debole espressione a livello della piastra neurale anteriore e nelle cellule delle creste neurali, mentre è più marcata l’espressione a livello dell’abbozzo dell’occhio e del mesoderma presomitico. A stadio di bottone caudale il gene e’ espresso in tutte le strutture della testa, ad esclusione dell’organo adesivo, ed inoltre a livello del mesoderma dell’abbozzo della coda.
Per analizzare il ruolo di Jhdm1d durante lo sviluppo abbiamo utilizzato l’approccio del Knock down genico mirato ad inibire specificamente la traduzione del RNA messaggero. A questo scopo, allineando tutte le sequenze EST corrispondenti a Jhdm1d presenti in banca dati che comprendessero la regione intorno all’inizio traduzione del RNA messaggero, e’ stato possibile disegnare uno specifico oligonucleotide Morpholino antisenso (MoJhdm1D). Successivamente, la sequenza target del messaggero è stata clonata all’interno del vettore di epressione pCS2+MT in modo da valutare l’efficacia di MoJhdm1D nel riconoscere la specifica sequenza e inibirne la traduzione.
Gli embrioni iniettati con MoJhdm1D in posizione marginale, a stadio di blastula mostrano la repressione specifica di geni regolati positivamente dal signaling di FGF4: XBra nella zona marginale, e FoxD5a nel neuroectoderma presuntivo.
Esperimenti preliminari di microiniezione di MoJhdm1D in blastomeri dorsali-animali hanno mostrato che la formazione della piastra neurale anteriore e delle strutture al suo interno appaiono deregolate. In particolare, a stadio di neurula, si osserva un’alterata espressione di Otx5b ed un’espansione dell’espressione di Rx1, un marcatore del territorio retinico, e dell’espressione di N-tubulina a livello del ganglio del trigemino. Sono previsti ulteriori esperimenti per approfondire il ruolo di Jhdm1D nella formazione della piastra neurale anteriore e nella retinogenesi.