• matrice extracellulare
• metalloproteasi

Le planarie (Platelminti, Tricladi) sono invertebrati unici nel mondo animale per la presenza di una consistente popolazione di cellule staminali pluripotenti nel tessuto mesenchimale (parenchima) degli animali adulti. Queste cellule, chiamate neoblasti, presiedono il turnover di tutti i tipi differenziati di cellule e sono responsabili delle straordinarie capacità rigenerative di questi animali.
La matrice extracellulare (ECM), composta da integrine, proteoglicani, fibronectina e collagene, ha un importante ruolo in una varietà di processi biologici correlati con la formazione di tessuti ed organi degli animali multicellulari. Questa struttura subisce un drastico rimodellamento durante la rigenerazione delle planarie per permettere la migrazione dei neoblasti verso la regione del taglio.
Le metazincine sono un gruppo di zinco proteasi di matrice che hanno un ruolo fondamentale nel processo di rimodellamento proteolitico della ECM. Questi enzimi possono infatti regolare migrazione e differenziamento cellulare, come anche la morfogenesi dei tessuti, per esempio interagendo con molecole segnale.
Durante la preparazione della tesi di laurea ho identificato in silico i geni codificanti metalloproteasi nel genoma della planaria Schmidtea mediterranea, una specie modello per studi molecolari, tramite applicazione di metodiche bioinformatiche. S. mediterranea ha infatti un genoma completamente sequenziato ed inoltre sono disponibili diverse collezioni di EST (Expressed Sequence Tag), analisi di profili di espressione eseguiti tramite microarray, oltre a numerosi marcatori molecolari. L’analisi in silico del genoma mi ha permesso di identificare geni codificanti proteine ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease), Astacine e geni codificanti MMP (Matrix MetalloProtease). In particolare, sono stati identificati ed ulteriormente caratterizzati, quattro geni che codificano potenziali metalloproteasi di matrice, che hanno un predetto sito catalitico Zn-metalloproteasico. L’analisi in silico indica tuttavia che uno di questi geni codifica una proteina presumibilmente inattiva, poiché non sono conservati due dei tre residui amminoacidici fondamentali per la catalisi. Esperimenti di PCR condotti su DNA genomico e cDNA confermano i dati ottenuti dall’analisi in silico. Utilizzando BLAST e SMART ho potuto identificare e classificare le tre MMP attive in base ai domini conservati. Due delle proteine dedotte sono costituite solamente da un prodominio e da un dominio catalitico: per tale motivo sono state classificate come matrilisine (MMP1 e MMP2). La terza presenta, oltre al prodominio e dominio catalitico, un dominio transmembrana N-terminale e quattro domini “emopexin-like”: per questo motivo è stata classificata come MMP di membrana di Tipo II (MT2-MMP). L’analisi dell’organizzazione genomica delle metalloproteasi, condotta confrontando i contig di ESTs con la sequenza genomica, ha chiarito che mmp1 e mmp2 hanno un’organizzazione introni-esoni simile, mentre mt2-mmp presenta un pattern introni-esoni completamente diverso. Utilizzando primers specifici ho amplificato e clonato le sequenze di ciascun gene. I cloni sono stati utilizzati per sintetizzare sonde specifiche per esperimenti di ibridazione in situ, che mi hanno permesso di localizzare i trascritti in planarie intatte e rigeneranti. Esperimenti funzionali mediante RNA interference (RNAi) mostrano che l’ablazione funzionale di mmp1 provoca lesioni negli animali, suggerendo un ruolo fondamentale di questo gene nel mantenimento dell’omeostasi tissutale. mmp2-RNAi sembra non dare alcun fenotipo, mentre il silenziamento del gene mt2-mmp provoca un significativo ritardo della rigenerazione.