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Negli ultimi anni la comunità scientifica, grazie all’avvento delle nuove tecnologie, ha visto cambiare radicalmente le metodologie di diagnostica in campo medico e biologico. Questi nuovi approcci di ricerca hanno spesso portato a dover rivedere teorie ormai consolidate e ritenute alla base di molti processi fisici e soprattutto biologici. È questo il caso dei sistemi di comunicazione per via chimica utilizzati dagli organismi viventi.
In particolare, i risultati ottenuti dai nuovi studi sui gradienti di concentrazione hanno convalidato le ipotesi in base alle quali la vita delle cellule si basa sulla generazione e l’effetto dei gradienti di concentrazione delle biomolecole che interagiscono con essa.
I gradienti di concentrazione di particolari composti chimici infatti risultano essere fondamentali per numerosi processi biologici, rivestendo un ruolo di primaria importanza soprattutto a livello dello sviluppo embrionale e della morfogenesi.
Fino a qualche anno fa si riteneva che una cellula fosse in grado di rilevare la concentrazione puntuale di una molecola attraverso specifici recettori posti sulla membrana cellulare e che questo inducesse una risposta cellulare proporzionale alla concentrazione della molecola stessa; recenti scoperte hanno invece dimostrato che è possibile ottenere risposte cellulari diverse anche in presenza di uguali concentrazioni della molecola in esame in condizioni tempo e spazio dipendenti; la generazione di un gradiente di concentrazione quindi può indurre diverse risposte cellulari, dipendenti sia dalla fase del ciclo vitale che dall’interazione che presentano le cellule in coltura.
Da qui sono nati i primi studi che hanno dimostrato come i chemiorecettori sono capaci di modificare il loro stato di eccitazione in modo proporzionale sia alla concentrazione della molecola rilevata che all’interazione con le cellule adiacenti; questo “stato” permane anche dopo il cambiamento della concentrazione della molecola in esame, lasciando pertanto il recettore in una condizione eccitata o inibita. Il concetto di “stato” del recettore può essere interpretato quindi come una memoria dei recettori stessi, rendendoli così capaci di valutare non solo la concentrazione puntuale di una determinata molecola, ma anche la sua variazione nello spazio e nel tempo.
Alla luce di queste nuove scoperte si è pensato di progettare e realizzare un sistema capace di sottoporre intere colture cellulari a gradienti di concentrazione definiti nello spazio e nel tempo, al fine di studiare i meccanismi di risposta cellulare nei confronti di determinati stimoli chimici esterni.
Obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quindi quello di progettare, modellizzare, realizzare e testare, mediante farmaci, un dispositivo microfabbricato in grado di generare un gradiente di concentrazione con risoluzione spaziale micrometrica all’interno di una camera di coltura dalla topologia ben definita.
Al fine di valutare la risposta cellulare in condizioni fisiologiche, è stato necessario realizzare il dispositivo in un materiale biocompatibile, facilmente sterilizzabile e capace di isolare la coltura cellulare dall’ambiente esterno. La cella di coltura inoltre è stata realizzata in materiale completamente trasparente al fine di permettere l’osservazione al microscopio della coltura durante l’intero esperimento.
Una volta stabilita la geometria del sistema, sono state effettuate delle prove di simulazione, con un software dedicato, per la valutazione del gradiente generato e l’analisi del profilo di velocità dei flussi all’interno della cella di coltura.
Per la realizzazione del dispositivo è stata utilizzata una tecnica di microfabbricazione: la soft-litografia. Con tale metodologia è stato possibile ottenere un dispositivo composto da una rete di microcanali che, a partire da due soluzioni in ingresso, è capace di sviluppare un gradiente di concentrazione all’interno della camera di coltura; inoltre il dispositivo micrometrico, minimizzando i volumi di soluzione necessari ed il numero di cellule impiegate per la realizzazione di un esperimento, permette di ridurre i costi di funzionamento del dispositivo.
Come detto in precedenza, il materiale in cui è realizzato il dispositivo deve avere le caratteristiche di biocompatibilità, trasparenza, facilità di sterilizzazione; un materiale che presenta tali caratteristiche è il polidimetilsilossano (PDMS).
Successivamente alla fase di realizzazione, il sistema è stato testato per verificare i risultati ottenuti dalla simulazione. Caratterizzato il funzionamento del sistema in portata ed in velocità, è stato inoltre valutato il gradiente generato dal sistema e la sua risoluzione spaziale.
Per quanto riguarda invece la fase relativa ai test cellulari, questi sono stati effettuati al fine di valutare l’analisi tossicologica di anestetici locali. Sono stati effettuati quindi dei test su cellule muscolari di topo C2C12, differenziate e non, utilizzando come anestetici locali la bupivacaina e lidocaina in condizioni sia statiche che dinamiche.