• cAMP
• FSH
• FSHr
• G Protein
• hCG
• LH
• LHr
• TSH

Da lavori precedenti è emerso che la molecola 1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane, noto
come DDT, interferisce con la funzione tiroidea. In questo lavoro di tesi si è voluto indagare su
quale sia il meccanismo con cui la molecola del DDT determina tale interferenza.
Il legame dell’ormone ipofisario TSH al suo recettore, appartenente alla famiglia dei recettori
glicoproteici associati a proteine G, causa un incremento dell’attività dell’enzima adenilato ciclasi
che si traduce in un aumento della quantità di AMP ciclico (cAMP). Da studi su cellule esprimenti
il recettore per il TSH e trattate con 1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane, si è compreso
che l’azione di questa molecola è diretta su questo recettore. In particolare,mediante prove
funzionali di attività dell’enzima adenilato ciclasi,si è potuto notare che il DDT inibisce l’accumulo
di cAMP in cellule Chinese hamster ovary (CHO)-K1 stabilmente trasfettate con il recettore TSH
(TSHr), sia quello indotto dall’attività basale del recettore, sia quando il recettore è stimolato con
TSH bovino (bTSH). Inoltre si è osservato che la digestione del dominio extracellulare (ECD) con
tripsina o la rimozione dell’ECD come nel mutante TSHr trunk non contrastano l’attività inibitoria
esercitata dal DDT.
Per valutare la specificità dell’azione del DDT nei confronti del recettore per il TSH sono state
condotte prove funzionali di attività dell’enzima adenilato ciclasi in cellule CHO K1 e COS 7
(African green monkey kidney fibroblast ) stimolate con il Forskolin, che è un attivatore di tutte le
ciclasi. In questo caso il DDT esercita una debole inibizione nei confronti della stimolazione indotta
da Forskolin, mentre non determina alcuna inibizione in cellule trasfettate stabilmente con il
recettore dopaminergico D1 e adenosinico A2a stimolati rispettivamente con dopamina e 5’-(Nethyl-
carboxamido)-adenosine (NECA). Inoltre il trattamento con DDT non esercita alcun effetto
sul recettore Beta2 adrenergico endogenamente espresso nelle cellule COS-7. Questi risultati
confermano la specificità d’azione del DDT verso il recettore per il TSH e suggeriscono l’ipotesi
che il DDT possa avere un ruolo come agonista inverso non competitivo nei confronti del recettore
per il TSH. L’effetto inibitorio del DDT è stato osservato per concentrazioni nell’ordine del
micromolare alto; tale concentrazione normalmente non viene raggiunta quando questa sostanza
viene usata come insetticida. Il passo successivo è stato quello di ricercare analoghi del DDT con
attività inibitoria sul recettore, ma efficaci per concentrazioni più basse. Dall’attività di screening di
varie molecole analoghe come per esempio il dietilstilbestrolo ed altre, quella più attiva è risultata
essere la Quercetin A, che è un fitosteroide. Da questi risultati abbiamo capito che la componente
steroidea è importante per l’inibizione. Così abbiamo iniziato a studiare l’effetto dell’estradiolo
sulla induzione di cAMP da parte di tutti i recettori per gli ormoni glicoproteici. Quello che
abbiamo osservato è che il beta-estradiolo è il più potente inibitore dell’attività dei recettori
glicoproteici LH e FSH.
Ulteriori studi sono stati condotti per approfondire il meccanismo di inibizione del DDT e altri
steroidi sui recettori glicoproteici. In particolare, in base a uno studio (Hoffman et al. Nature 2005)
condotto su recettori accoppiati a proteine G, è stato messo a punto un protocollo sperimentale che
utilizza la capacità di un composto arsenicato (Flash) di diventare fluorescente a seguito del suo
legame con un sequenza di soli sei aminoacidi. Modificando la sequenza del nostro recettore TSHr
con l’aggiunta della sequenza bersaglio è stato ottenuto un recettore chimerico funzionante che è
stato trasfettato nelle Cos7 transientemente per poter valutare l’attività e la capacità
effettiva di legare Flash, e quindi di permettere la evidenziazione dell recettore. Il vantaggio di questa tecnica
consiste nell’ovviare al problema dell’ingombro sterico di proteine fluorescenti attaccate al
recettore; i comuni cromofori sono proteine di dimensioni piuttosto grandi che spesso
compromettono l’attività e impediscono la corretta localizzazione dei recettori. Le piccole
dimensioni di FlAsH non causano tali inconvenienti.