• attività fosfotrasferasica
• curva di crescita
• diametro cellulare
• funzionalità mitocondriale
• interazione proteina-proteina
• proliferazione cellulare
• ros mitocondriali
• sintesi proteica
• western blotting

Oggetto di studio della mia tesi è la 5'-nucleotidasi citosolica II (cN-II). (cN-II) è un enzima bifunzionale la cui attività ed espressione gioca un ruolo chiave nell'equilibrio del pool dei nucleotidi, nei pathways nucleotidi-dipendenti e nella morte cellulare programmata.
cN-II è molto conservata a livello tassonomico e ciò suggerisce un ruolo fondamentale nelle cellule eucariotiche.
Le nucleotidasi sono enzimi in grado di catalizzare l'idrolisi di un nucleotide in nucleoside e fosfato; cN-II è una 5'-nucleotidasi che ha come substrato preferibilmente IMP/GMP e i suoi deossi-derivati.
L'attività di cN-II, la sua struttura ed espressione ha attirato l'attenzione di svariati gruppi di ricerca implicati in campi quali: la biochimica, la cristallografia, la biologia molecolare, la farmacologia, l'oncologia e la genetica.
cN-II è un enzima bi-funzionale in quanto è capace di agire sia come una fosfatasi sia come una fosfotransferasi e queste attività possono contribuire al mantenimento del bilanciamento della concentrazione intracellulare delle purine.
Oltre alla sua attività enzimatica, cN-II svolge attività di interazione proteina-proteina, con proteine quali Ipaf, coinvolta nei meccanismi di difesa dell'immunità innata e quindi nella sopravvivenza cellulare.
E' dimostrato inoltre, che cN-II è implicata nei processi di proliferazione cellulare e nello sviluppo dei tumori.
Sulla base di ciò il mio studio intende evidenziare il ruolo di cN-II nella proliferazione cellulare e nello sviluppo dei tumori oltre che le interazioni che questa nucleotidasi ha con altre proteine implicate nei processi oncogenetici ed oncosoppressori e/o nei processi infiammatori.
Per il mio studio ho utilizzato cellule di adenocarcimoma dell'epitelio alveolare umano, una linea cellulare denominata A-549. Ho utilizzato tre tipi cellulari: wilde-type tumorale, cellule controllo ingegnerizzate con un plasmide vuoto e cellule ingegnerizzate con un plasmide in cui è inserito uno short-haerpin per silenziare parzialmente il gene che codifica per la cN-II.
I tre tipi cellulari sono stati esposti, a tempi diversi, a differenti concentrazioni di 2-deossiglucosio, una molecola che abbassa la carica energetica delle cellule e ne modifica anche il potere riducente, permettendo in questo modo di valutare la proteina di interesse in condizioni metaboliche differenti.
Un'altra parte dell'esperimento ha mirato ad evidenziare parametri quali la massa mitocondriale, la concentrazione dei ROS mitocondriali, il potenziale di membrana mitocondriale, la correlazione tra diametro cellulare e sintesi proteica, l'attività fosfotrasferasica dell'enzima e la curva di crescita dei tre tipi cellulari.
Al fine di individuare le interazioni di cN-II con altre proteine implicate nella proliferazione cellulare e/o nel ciclo cellulare, ho inoltre effettuato esperimenti di immunoblotting con proteine quali akt, m-tor, ampk.
I risultati ottenuti indicano che cN-II è implicata nei processi di proliferazione cellulare. Un'evidente alterazione riguarda la sintesi proteica la quale è drasticamente diminuita nelle cellule in cui cN-II è parzialmente silente. Anche a livello della funzionalità mitocondriale è stata evidenziata una maggior produzione di ROS nelle cellule con il gene per cN-II silenziato, mentre non vi sono alterazioni per quanto riguarda gli altri parametri analizzati a livello della funzionalità mitocondriale.