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Tesi etd-06302011-170220


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
CAMILLO, DANIELA
URN
etd-06302011-170220
Title
UTILIZZO DI UN SENSORE GENETICAMENTE CODIFICATO PER L’IMAGING DEL CLORO IN MODELLI FISIOPATOLOGICI
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
NEUROBIOLOGIA
Commissione
relatore Ratto, Gian Michele
correlatore Nardi, Irma
correlatore Pellegrino, Mario
Parole chiave
  • Clophensor
  • Cloro
  • GABA
  • due fotoni
  • vettori lentivirali
Data inizio appello
21/07/2011;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
21/07/2051
Riassunto analitico
L’anione Cloruro, gioca un ruolo cruciale nella regolazione dinamica del potenziale di membrana nei neuroni, principalmente attraverso i recettori GABAA; nonostante il GABA sia considerato il neurotrasmettitore inibitorio per eccellenza, il suo effetto sul potenziale di membrana, dipende strettamente dal potenziale di inversione del Cloro e quindi dalla sua differenza di concentrazione a cavallo della membrana.<br>Nel sistema nervoso maturo, la concentrazione di cloro intracellulare, viene mantenuta bassa rispetto all’ambiente extracellulare di conseguenza l’apertura delle conduttanze Cloro, determina un flusso netto di cariche negative dentro la cellula, generando un effetto iperpolarizzante . D’altra parte il potenziale di inversione del Cloro, non è un parametro costante ma varia sia durante lo sviluppo, che in precise condizioni patologiche e fisiologiche. L’omeostasi del Cloro dipende dall’attività di due cotrasportatori, NKCC1 e KCC2 che hanno effetti opposti sulla [Cl-]i . NKCC1 opera un simporto di Na+:K+:2Cl- sfruttando il gradiente del Na+ per importare Cl-; KCC2 invece estrude Cl- dalla cellula servendosi del gradiente K+. È stato recentemente dimostrato, che nelle prime fasi dello sviluppo l’attività di NKCC1 prevale su quella di KCC2 , di conseguenza l’effetto delle afferenze GABAergiche è depolarizzante a causa di un’elevata [Cl]i . Intorno a P10 i ruoli si invertono: NKCC1 viene downregolato e KCC2 diventa il principale regolatore della [Cl]i . È da questo momento che il GABA acquisirà la sua principale funzione di neurotrasmettitore inibitorio. Ma anche nel sistema nervoso maturo, il potenziale di inversione del Cloro può subire drastiche variazioni, ad esempio in presenza di una sostenuta attività gabaergica, durante la quale l’efficienza di KCC2 può non essere sufficiente a rinormalizzare la [Cl]i .<br>In questo contesto si determina uno spostamento transitorio dell’ ECl, verso valori meno negativi, che possono addirittura superare il potenziale di riposo della membrana. Inoltre KCC2 sembra essere regolato in maniera attività dipendente e da fattori endogeni quali le neurotrofine (BDNF). Anche in modelli epilettici è stata dimostrata un’importante alterazione dell’espressione di KCC2, con conseguente squilibrio dell’omeostasi del Cloro.<br>L’effetto della segnalazione GABAergica dipende anche dal fenomeno noto come “Shunting Inhibition”, rappresentato dalla perdita di corrente da parte della membrana. Questo processo permette un maggiore controllo, da parte dell’anione cloruro, del potenziale di membrana, i cui valori rimangono vicini a quelli del potenziale di equilibrio del Cloro.<br>Lo scopo della mia tesi è quello di studiare le dinamiche delle variazioni di [Cl-]i , ad elevata risoluzione spazio temporale, a livello di singola cellula e di network neurale. A tale scopo ho utilizzato una sonda fluorescente, ClopHensor , geneticamente codificata, le cui proprietà spettroscopiche cambiano al variare delle [Cl] e del pH. Tale sensore è composto da due proteine fluorescenti unite da un linker aminoacidico, la prima costituita da una molecola di EGFP modificata, in maniera da permettere il legame con il Cl- e la seconda una molecola di DsRed monomerica insensibile sia al Cl- che al pH, necessaria per rendere le misure raziometriche. Utilizzando opportune lunghezze d’onda di eccitazione è possibile ottenere misure assolute di Cloro e di pH, tramite la microscopia confocale. Nella prospettiva di utilizzare ClopHensor per l’imaging in vivo, mi sono occupata della caratterizzazione degli spettri di eccitazione a due fotoni del sensore. Grazie all’elettroporazione in utero nel ratto (wistar), è stato possibile trasfettare i neuroni con un costrutto appositamente clonato, per l’espressione di ClopHensor nel mammifero. In base allo stadio embrionale in cui viene iniettato il costrutto, è possibile selezionare specifiche classi neuronali che esprimeranno ClopHensor. I ratti elettroporati, sono stati poi sottoposti a delle sessioni di imaging in vivo a due fotoni e successivamente sono state ricavate dagli stessi animali, delle slices sulle quali è stato possibile eseguire delle misure di imaging, ad un fotone al microscopio confocale. Allo scopo di ottimizzare l’espressione del sensore, dirigendolo in specifici sottotipi neuronali e di passare al topo (C57BL/6J) come modello sperimentale (utilizzando animali transgenici come modelli patologici), si sta clonando il sensore per il cloro all’interno di vettori lentivirali per l’espressione di ClopHensor in vivo.<br><br>
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