• neurotrasmettitore
• tossine botuliniche

Le tossine botuliniche sono enzimi batterici che bloccano il rilascio di neurotrasmettitore a livello delle sinapsi centrali e periferiche; la loro azione a livello della giunzione neuromuscolare viene utilizzata in clinica per il trattamento di disturbi del movimento quali le distonie e la spasticità. Esistono sette serotipi diversi di tossine botuliniche, che vengono indicati con le lettere dalla A alla G (BoNT/A-BoNT/G). Il loro meccanismo d’azione consiste nel tagliare alcune proteine del complesso SNARE : VAMP, SNAP-25 o sintaxina, interferendo così con la fusione delle vescicole al terminale sinaptico.
Comunemente si riteneva che le azioni delle BoNTs rimanessero ristrette al sito di iniezione; tuttavia, dati recenti del nostro laboratorio indicano una possibilità di trasporto assonale. Il trasporto assonale potrebbe spiegare alcuni degli effetti a livello di sistema nervoso centrale che sono stati riscontrati nei pazienti trattati intramuscolarmente con le BoNTs. In questa tesi ho quindi investigato la possibilità di trasporto assonale utilizzando la BoNT/A, che è il serotipo più usato a livello clinico. Gli studi sono stati condotti sul sistema visivo di Ratto adulto, in cui abbiamo valutato sia il trasporto anterogrado (iniettando la BoNT/A nell’umor vitreo dell’occhio) che il trasporto retrogrado (iniettando la tossina nel collicolo superiore). In questo modo è stato possibile valutare la propagazione anterograda e retrograda degli effetti della tossina andando a valutare il taglio proteolitico del substrato di BoNT/A: la proteina sinaptica SNAP-25.
A seguito di iniezioni intraoculari, l’analisi biochimica ha evidenziato alti livelli di SNAP-25 tagliata nella retina trattata e quantità significative dello stesso substrato tagliato nel collicolo controlaterale all’iniezione. Al contrario, nessun segnale si ritrovava nel collicolo ipsilaterale, escludendo quindi l’ipotesi di una diffusione sistemica della BoNT/A. Inoltre, quando la propagazione anterograda era bloccata dall’iniezione di colchicina, non si ritrovava SNAP-25 tagliata nel collicolo controlaterale, dimostrando così il ruolo cruciale del trasporto mediato dai microtubuli. A livello immunoistochimico la marcatura di SNAP-25 tagliata nel collicolo è associata a fibre e terminali sinaptici. In esperimenti preliminari non abbiamo riscontrato una colocalizzazione significativa tra SNAP-25 tagliata e marcatori delle terminazioni retiniche (il trasportatore vescicolare per il glutammato vGlut2 e il tracciante anterogrado tossina del colera – CTB – iniettato nell’occhio), suggerendo quindi che l’effetto della BoNT/A possa estendersi a sinapsi distinte da quelle delle cellule gangliari.
Dopo iniezioni nel collicolo superiore, l’analisi immunoistochimica ha rivelato molte sinapsi positive per SNAP-25 tagliata nella retina (propagazione retrograda). In particolare, risultano marcate le cellule amacrine colinergiche e le cellule bipolari, due tipi cellulari presinaptici alle gangliari. Questo dato ci suggerisce la capacità della BoNT/A di eseguire transcitosi. Inoltre, anche alcuni fotorecettori sono risultati positivi per SNAP-25 tagliata e questo dato suggerisce che la BoNT/A possa compiere un secondo ciclo di transcitosi.
Esperimenti in corso sono volti a determinare se questa propagazione anterograda e retrograda sia associata a effetti funzionali. In particolare stiamo valutando se la presenza di SNAP-25 tagliata in sinapsi lontane dal sito di iniezioni possa indurre un blocco del normale ciclo di esocitosi delle vescicole.
In conclusione, i nostri dati dimostrano che gli effetti della BoNT/A si propagano sia anterogradamente che retrogradamente all’interno del sistema visivo del Ratto. Queste osservazioni potrebbero avere implicazioni importanti per l’uso clinico della BoNT/A.