• virus erpetici
• hiv
• colture cellulari
• sarcoma di kaposi
• pcr
• hhv8

Il virus erpetico umano 8 (HHV8) o erpesvirus umano associato al sarcoma di Kaposi (KSHV) è l’agente eziologico del sarcoma di Kaposi (KS), una neoplasia angioproliferativa e di due rari disordini linfoproliferativi: il linfoma ad effusione primaria (PEL/BCBL) e la malattia di Castelmann.

Esistono 4 varianti del KS: endemica, iatrogena, epidemica, cronica o classica, caratterizzate da una tipica aggressività, distribuzione geografica, incidenza in fasce di età e in individui di sesso maschile e femminile.

La sieroprevalenza per HHV8 ha una distribuzione geografica estremamente eterogenea: in America e in Asia è bassa (2-5%), in alcune aree del Mediterraneo varia dal 2% al 40%, in Africa raggiunge il 40-50%. In Italia la sieroprevalenza per HHV8 aumenta da nord a sud dal 10% al 30% e raggiunge il 35% in Sicilia e Sardegna.
Sono state dimostrate diverse modalità di trasmissione dell’infezione: sessuale, attraverso la saliva, in seguito a trasfusione o trapianto d’organo, attraverso aghi infetti, raramente per via verticale o attraverso il latte materno.

Studi filogenetico-epidemiologici della regione ipervariabile ORF-K1 del genoma di HHV8 hanno individuato 5 genotipi virali (A, B, C, D, E) ad oggi associati solo ad una differente distribuzione geografica dell’infezione.

Scopi del presente lavoro di tesi sono stati:
1 l’analisi dell’incidenza sieroepidemiologica e molecolare virale in vari fluidi biologici appartenenti a soggetti sardi affetti da KS
2 lo studio della sieropositività di tali soggetti per anticorpi rivolti contro antigeni LANA e K8.1 di HHV8 per correlare la DNA positività con la sieroconversione,
3 l’analisi dei sottotipi virali rilevabili in vari fluidi biologici e in tempi diversi,
4 l’ identificazione di caratteristiche peculiari dei ceppi virali circolanti nell’area del Mediterraneo.

L’incidenza sieroepidemiologica e molecolare di HHV8 e lo studio della sieropositività per anticorpi rivolti contro antigeni LANA e K8.1 è stata eseguita su 30 pazienti KS tutti residenti nell’area di Sassari. I risultati hanno rilevato una sieropositività sovrapponibile per gli anticorpi anti LANA e K8.1 con un’incidenza del 100%.
La tipizzazione, che ha avuto successo in 23 KS e ha rilevato che 10 pazienti erano infetti con il ceppo A1, 4 con il ceppo A3, 1 con il ceppo A4, 7 con il ceppo C2 ed 1 con il ceppo C3.
La quantificazione della carica virale in sangue e saliva dei 30 pazienti KS e l’analisi statistica dei dati non ha rilevato alcuna correlazione tra la carica virale in saliva ed in sangue (R = 0.239, correlazione di Spearman). Considerando tutti i pazienti la media della carica virale rilevata in saliva (68.0678 copie/ml) è risultata significativamente più alta di quella nel sangue (736 copie/ml) (p= 0,02, test di Wilcoxon per coppie di campioni), mentre analizzando separatamente i gruppi di pazienti affetti da genotipi diversi la differenza tra la carica virale nella saliva risulta significativamente maggiore (p = 0,004, test di Wilcoxon) nei pazienti affetti dal ceppo A. Una carica virale significativamente maggiore in saliva rispetto al sangue è stata ritrovata nei pazienti infetti dal genotipo A rispetto a quelli infetti dal genotipo C (P = 0.029, test Mann-Whitney), inoltre settando un cut-off a 1000 copie/ml, l’80,0% dei KS infettati dal ceppo A e solo il 14,3% di quelli affetti dal ceppo C presentano cariche virali in saliva significativamente superiori al cut-off (p = 0.007, test di Fisher). La stessa analisi statistica condotta sulle cariche virali in sangue non ha dato risultati statisticamente significativi.
In 2 pazienti KS è stata analizzata separatamente la sieorpositività per anticorpi anti-LANA ed anti K8.1, la carica virale in siero, sangue e saliva ed il genotipo infettante su campioni seriali prelevati in concomitanza di trattamento farmacologico. I risultati hanno dimostrato che solo l’andamento degli anticorpi anti-LANA correla con recrudescenze della malattia, che l’andamento della carica virale in saliva è inversamente proporzionale a quella nel sangue e nel siero e che un aumento della replicazione virale nel cavo orale è associata ad un miglioramento delle condizioni cliniche del paziente. La genotipizzazione eseguita su tutti i fluidi biologici a disposizione ha dimostrato che entrambe i KS erano affetti dal ceppo A1.
Poiché i dati sieroepidemiologici e molecolari ottenuti indicavano l’esistenza di un più elevato tropismo dei ceppi A verso le cellule epitelioidi, come quelle che rivestono il cavo orale, è stata riattivata la replicazione virale mediante trattamento con forbolo estere (TPA) in due linee cellulari BCBL1 e BC3 latentemente infette rispettivamente con il ceppo A1 e C3 di HHV8, il virus rilasciato nel suranatante, concentrato e purificato è stato utilizzato per infettare due linee cellulari umane: una di origine epiteliale (HEK293) ed una di origine linfoide (PBMC). Il tasso di infettività e di replicazione dei due ceppi valutato mediante IFA indiretta e real-time PCR ha rilevato che solo nelle cellule di origine epiteliale infettate con il ceppo A1 la replicazione virale raggiunge valori superiori a 103 ed un’elevata espressione antigenica.
La discrepanza tra i risultati dei test sierologici e molecolari confermano i dati presenti in letteratura che evidenziano una mancanza di correlazione tra la sieropositività e la presenza del DNA virale dovuta probabilmente alla produzione intermittente di anticorpi.
I risultati dello studio filogenetico e della quantificazione della carica virale confermano, che la saliva è il fluido dove il DNA virale è maggiormente rilevabile, la presenza nell’area del Mediterraneo di entrambe i ceppi virali A e C, che il ceppo virale infettante rimane costante nel tempo e nei vari distretti corporei, ma soprattutto mettono in luce per la prima volta un maggiore tropismo e tasso replicativo dei ceppi A nelle cellule di origine epiteliale, confermato dagli esperimenti condotti in vitro.