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• modello bio-matematico
• HBsAg kinetics
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• HBV
• hepatitis B
• epatite B
• nucleos(t)ide analogue treatment
• relapse
• trattamento con analoghi nucleos(t)idici
• riattivazione
• mathematical modeling

L’infezione da virus dell’epatite B (HBV) è ancora oggi uno dei maggiori problemi di salute pubblica mondiale; l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha calcolato che oltre 2 miliardi di persone siano state infettate da HBV e che 400 milioni siano cronicamente infette; mentre si stima che nel 2015 siano morte 887 mila persone per le complicanze (cirrosi ed epatocarcinoma) dell’epatite cronica B.
Nonostante sia disponibile un vaccino efficace e trattamenti antivirali in grado di bloccare l’evoluzione dell’epatite cronica B, rimane alto l’interesse a sviluppare nuove terapie con maggiore efficacia e soprattutto che non richiedano un trattamento a lungo termine. Infatti, quelle in uso, interferone- (IFN-) e analoghi nucleos(t)idici, non sono in grado conseguire una cura sterelizzante (“sterilizing cure”) dell’infezione con perdita di HBsAg dal sangue, scomparsa dell’HBV DNA in circolo e nel fegato, perdita del cccDNA e dell’HBV-DNA integrato nel genoma dell’ospite. L’obiettivo massimo raggiungibile al momento è quello della cosiddetta cura funzionale (“functional cure”), definita come la perdita di HBsAg, con o senza comparsa degli anticorpi anti-HBs, associata a persistente assenza di HBV-DNA circolante dopo sospensione del trattamento antivirale.
Gli analoghi nucleos(t)idici (NAs), che rappresentano la classe di farmaci più utilizzata, inibiscono la retrotrascrizione del pre-genoma di HBV (HBV-RNA) in HBV-DNA, ma non riducono in modo significativo la matrice replicativa del virus (cccDNA) e non hanno un’azione immuno-modulatrice diretta. Si ritiene che tale meccanismo d’azione, in grado di agire su un solo intermedio replicativo senza modificare direttamente lo stato dell’infezione, sia alla base dello scarso effetto dei NAs sulla riduzione dell’HBsAg. Alcuni pazienti, tuttavia, raggiungono livelli bassi di HBsAg che associano ad una maggiore probabilità della sua perdita dopo la sospensione del trattamento. Pertanto, la misurazione dell’HBsAg in corso di terapia con NAs viene considerato un marcatore che potrebbe contribuire all’identificazione dei soggetti con più elevata probabilità di raggiungere la cura funzionale dopo la sospensione del trattamento. Tuttavia, non essendo al momento possibile dimostrare l’acquisizione di un’efficace risposta immunitaria con gli strumenti diagnostici a disposizione, le condizioni che permettono la sospensione in sicurezza del trattamento secondo le Linee Giuda europee sono solamente la sieroconversione HBeAg/anti-HBe nei pazienti HBeAg positivi e la perdita dell’HBsAg nei pazienti HBeAg negativi, che si verifica in una piccola percentuale (intorno al 5% dei casi dopo 10 anni di terapia) .
Negli ultimi anni, sono emerse nuove importanti informazioni sui meccanismi di produzione dell’HBsAg: due sono le fonti di HBsAg circolante, una da trascrizione del gene “S” presente nella matrice replicativa di HBV (cccDNA) e l’altra da trascrizione di sequenze dello stesso gene integrate nel DNA dell’epatocita. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che il turnover del cccDNA possa essere più rapido di quanto in precedenza stimato. Quindi, la persistenza dell’HBsAg circolante non è sempre indicativa del mancato raggiungimento di un efficace controllo immune della replicazione virale in quanto, quantomeno in pazienti in trattamento prolungato con NAs potrebbe essere prodotto prevalentemente da cellule con solo DNA integrato.
Infine, una nostra analisi preliminare in 90 pazienti trattati esclusivamente con NAs aveva evidenziato come il pattern di caduta di HBsAg non sia sempre costante, ma in un sottogruppo di pazienti abbia un andamento multifasico. Ciò è indicativo del fatto che ci siano più variabili che influenzano la riduzione dei livelli di HBsAg. In particolare, l’attività di clearance citolitica degli epatociti infetti potrebbe influenzare la cinetica di HBsAg, come suggerito dal fatto che livelli di ALT più bassi all’inizio del trattamento siano presenti nei pazienti senza declino di HBsAg, mentre livelli più alti associno con declino rapido bifasico.

Complessivamente, queste nuove conoscenze mostrano come siano numerosi e complessi i fattori che incidono sulle cinetiche di HBsAg e verosimilmente anche sul controllo immune dell’infezione da HBV. Tale complessità può esser descritta con modelli bio-matematici per meglio distinguere il contributo dei singoli fattori e testare la verosimiglianza delle assunzioni derivanti dalle nuove ipotesi biologiche.
In questo studio presentiamo un nuovo modello bio-matematico che permette di descrivere le dinamiche generali dell’infezione da HBV e le cinetiche di HBsAg in corso di terapia con NAs con lo scopo di:
• individuare le cause biologiche delle cinetiche complesse dell’HBsAg;
• utilizzare la spiegazione biologica di tali cinetiche per orientare il trattamento antivirale;
• predire il raggiungimento di un controllo immune dell’infezione da HBV e la possibilità di clearance dell’HBsAg;
• valutare il rischio di epatite severa in caso di riattivazione della replicazione virale dopo sospensione del trattamento.
Abbiamo applicato con successo il suddetto modello a 31 pazienti (10 femmine e 21 maschi), 29 HBeAg negativi e 2 HBeAg positivi ad inizio trattamento e poi negativizzatisi durante, con durata mediana di trattamento con NAs di 123,1 mesi (range 41,2-260,1).
In base al pattern di declino dell’HBsAg, sono stati distinti 3 profili principali:
• Pazienti senza declino di HBsAg: in 3/31 (9,7%) in cui si è osservata una sostanziale stabilità dei livelli di HBsAg durante tutta la durata della terapia;
• Pazienti con HBsAg in riduzione monofasica: in 18/31 (58,0%) in cui si è osservata una discesa esponenziale monofasica di HBsAg;
• Pazienti con HBsAg in riduzione multifasica: in 10/31 (32,3%) in cui è stato osservato un declino multifasico dei livelli di HBsAg durante il trattamento.
Complessivamente, la perdita dell’HBsAg è stata documentata in 6 pazienti tra quelli con riduzione multifasica (2 dopo sospensione della terapia). Entrambi i pazienti inizialmente HBeAg positivi hanno interrotto la terapia dopo perdita dell’HBeAg, manifestando recidive dell’epatite B che hanno richiesto la ripresa della terapia antivirale ed hanno avuto esiti clinici diversi: controllo immune efficace con perdita dell’HBsAg in un caso, recidiva severa con grave danno epatico senza perdita dell’HBsAg nell’altro caso.
Confrontando i parametri del modello calcolati nei 18 pazienti monofasici con quelli dei 10 pazienti multifasici sono emerse delle differenze statisticamente significative:
• Il valore medio delle ALT al momento di inizio di trattamento (ALT(0) U/L) è risultato essere più elevato nel gruppo dei multifasici (666565 vs 12195; P=0,000403);
• La media del numero di cellule infette iniziali [per definizione contenenti almeno una molecola di cccDNA (I(0)cccDNA)] è stata stimata essere più elevata nei pazienti con cinetica dell’HBsAg multifasica (4,571072,28107 vs 1,841071,23107; P=0,030581);
• Conseguentemente, anche la percentuale degli epatociti infetti al momento dell’inizio del trattamento (IcccDNA %H0) è risultata essere più elevata nei multifasici (22,0%±15,4% vs 54,8%±27,3%, P=0,015931)
• Il valore medio di HBsAg al momento di inizio di trattamento (HBsAg(0)) è risultato essere più elevato nel gruppo dei pazienti con cinetica dell’HBsAg multifasica (18.846,822.861,3 vs 4.421,92.876,2; P=0,027173);
• La produzione media di HBsAg da cccDNA (PcccHBs % su totale) è stato stimato essere maggiore nei pazienti con cinetica multifasica (53,3%27,3 vs 1,7%2,3; P=0,000019)
• La vita media del DNA integrato (Lftm intDNA) è risultato essere più lungo nel gruppo dei pazienti con cinetica dell’HBsAg monofasico (3.9382681 vs 1.340875; P=0,00655).

La rapida discesa dell’HBsAg osservata nei primi 6-24 mesi di terapia nei soggetti con caduta bifasica si spiega pertanto con una maggior riduzione in questi pazienti del numero di cellule infette (cccDNA positive) dovuta a due fattori: l’eliminazione citolitica delle cellule infette a cui si è sommato l’effetto di inibizione della sintesi di cccDNA con un suo conseguente depauperamento. La seconda fase caratterizzata da un declino più lento, paragonabile a quello dei soggetti con cinetica monofasica, può essere ricondotta ad una produzione di HBsAg prevalentemente da cellule con DNA integrato senza più cccDNA. La riduzione dei livelli di HBsAg prodotto in modo prevalente da integrato tende ad essere mediamente più veloce nei soggetti con profili multifasici, rispetto a quelli con declino monofasico (1340 vs 3938 giorni). Tali differenze non sono però sufficienti a spiegare le accelerazioni osservate nel periodo che precede la clearance dell’HBsAg. Non essendo plausibile un aumento dell’eliminazione citolitica delle cellule che producono HBsAg da integrato, poiché i livelli di transaminasi rimangono perfettamente normali, il modello spiega tale evento con un moderato aumento della velocità di eliminazione dell’HBsAg circolante associato ad una netta riduzione della produzione di HBsAg da cellule con DNA integrato

Nei due casi di recidiva di epatite B dopo sospensione della terapia, con evoluzioni cliniche differenti, il modello ha fornito interessanti informazioni riguardanti i diversi meccanismi di ripartenza dell’infezione al momento della recidiva:
• Nel caso del paziente con recidiva senza epatite severa, la sospensione del NA ha determinato una lenta e progressiva espansione delle cellule infette con cccDNA (da 22,3 a 8106 in 177 giorni), ma la produzione di nuovi virioni infettivi per singola cellula infetta è cresciuta lentamente (da 0,0002 a 0,004 virioni per cellula infetta al giorno), restando molto inferiore alla produzione calcolata ad inizio terapia (30,8 virioni per cellula infetta al giorno);
• Nel caso del paziente ID 219 con recidiva severa, la sospensione del NA ha determinato una più rapida espansione delle cellule infette con cccDNA (da 365 a 1,5107 in 57 giorni), con la produzione di nuovi virioni infettivi per singola cellula infetta che è cresciuta enormemente (da 0,0005 a 1,2 virioni per cellula infetta al giorno), raggiungendo livelli 10 volte superiori a quelli calcolati ad inizio terapia (0,12 virioni per cellula infetta al giorno). L’interpretazione fornita dal modello matematico fa quindi ritenere che il maggior determinante della severità della recidiva sia la incapacità del sistema immune di contenere la replicazione virale con meccanismi non citolitici.
In conclusione, la cinetica dei livelli di HBsAg (misurati con cadenza semestrale) in corso di terapia a lungo termine con analoghi nucleos(t)idici, analizzata con il nostro modello bio-matematico, ha fornito nuove informazioni utili ad identificare il sottogruppo di pazienti che raggiunge la cura funzionale dell’epatite B.
La sospensione della terapia in questi pazienti appare sicura anche in presenza di una transitoria recidiva della replicazione virale. Il modello bio-matematico, oltre a prevedere il mantenimento della risposta, è in grado di cogliere precocemente gli elementi caratterizzanti la dinamica della recidiva severa e di anticiparne la ripresa della terapia.
Infine, il modello ha messo in luce nuovi meccanismi biologici alla base del controllo immune dell’infezione che potranno essere oggetto di ulteriori studi; in particolare, l’inibizione a livello trascrizionale o post-trascrizionale della sintesi di HBsAg da sequenze integrate spiegherebbe la perdita dell’HBsAg anche con meccanismo non citolitico