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L’intestino umano è colonizzato da un’ampia varietà di microrganismi che costituiscono quello che oggi viene chiamato microbiota intestinale. È ormai chiaro che questa comunità microbica gioca un ruolo chiave nell’ospite umano con cui ha instaurato una relazione mutualmente benefica in anni di co-evoluzione. Infatti, i microbi intestinali aiutano a mantenere l’omeostasi, contribuendo allo sviluppo del sistema immunitario, prevenendo la colonizzazione da parte dei patogeni, fornendo energia e sostanze nutritive all’ospite e metabolizzando i componenti indigeribili della dieta e le sostanze xenobiotiche (Sun et al., 2014). Il notevole sviluppo tecnologico e bioinformatico degli ultimi anni ha permesso di caratterizzare le comunità microbiche sia in termini di struttura che di funzione, con una precisione senza precedenti (Cénit et al., 2014). Moltissimi studi hanno dimostrato la presenza di profonde alterazioni del microbiota intestinale in vari stati di malattia, suggerendo che l’ambiente microbico umano svolga un ruolo critico sia nel mantenimento della salute che nella patogenesi delle malattie. Identificare i componenti del microbiota coinvolti e chiarire i meccanismi molecolari della loro azione nell’indurre alterazioni patologiche o nell’esercitare attività benefiche di protezione, potrebbe fornire conoscenze utili per modulare la composizione della comunità intestinale al fine di prevenire o curare particolari patologie (Tlaskalová-Hogenová et al., 2011). È quindi importante sviluppare dei metodi rapidi, efficaci e altamente riproducibili applicabili in ambito clinico per analizzare la composizione delle comunità microbiche.
In questo contesto, i principali obiettivi di questo lavoro di tesi sono stati la messa a punto di un metodo in Real-time qPCR per la valutazione della composizione del microbiota intestinale umano; la caratterizzazione della comunità intestinale mediante sequenziamento con la piattaforma MiSeq dell’Illumina; la comparazione dei due metodi per valutare il tipo di risultati ottenuti, la concordanza e le eventuali criticità.
Nella prima fase di questo progetto di tesi entrambe le metodiche sono state applicate all’analisi del microbiota associato alla mucosa ileale di ratto, in un modello di enteropatia intestinale indotta da Diclofenac. I risultati ottenuti, essendo perfettamente in linea con quanto riportato in letteratura, hanno permesso di validare i due metodi sviluppati, sottolineando però che sono entrambi necessari per una completa caratterizzazione di una comunità microbica complessa. Infatti, il sequenziamento può fornire una visione completa della composizione di una comunità, rilevando anche microrganismi presenti in minime quantità o precedentemente sconosciuti, ma non è una tecnica quantitativa. D’altro canto la Real-time qPCR permette un’analisi qualitativa e quantitativa di una comunità, ma rileva soltanto i gruppi tassonomici specificamente riconosciuti dagli oligonucleotidi innesco utilizzati. I risultati ottenuti hanno anche permesso di stabilire il ruolo del microbiota intestinale nella patogenesi del danno alla mucosa indotto da FANS e di dimostrare l’efficacia della Rifaximina, un antibiotico ad ampio spettro, nel correggere lo stato di disbiosi intestinale osservato in seguito al trattamento con Diclofenac. Questi risultati suggeriscono che modulare la comunità microbica intestinale con un antibiotico scarsamente assorbito potrebbe essere un’interessante strategia per la prevenzione degli eventi avversi dei FANS sul tratto gastrointestinale inferiore.
Nella seconda fase di questo progetto di tesi, il metodo in Real-time qPCR messo a punto è stato applicato all’analisi del microbiota fecale umano di sei volontari sani. I risultati ottenuti, che concordano sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo con le informazioni riportate in letteratura, confermano la possibilità di applicare questo protocollo in ambito clinico. Questo metodo potrebbe consentire di individuare rapidamente soggetti con uno stato di disbiosi intestinale, predittivo della loro suscettibilità a determinate patologie e possibile bersaglio di eventuali azioni preventive e/o terapeutiche; inoltre, potrebbe essere utilizzato per uno screening iniziale dei pazienti, prima di ricorrere ad una più completa e costosa caratterizzazione qualitativa del microbiota intestinale mediante sequenziamento.