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Tesi etd-06292016-181522


Thesis type
Tesi di specializzazione (5 anni)
Author
BUZZIGOLI, ANDREA
URN
etd-06292016-181522
Title
Comparabilita tra protocolli di neutralizzazione in vitro in sieri di pazienti e concentrati di immunoglobuline
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA
Commissione
relatore Prof. Pistello, Mauro
Parole chiave
  • poliovirus
  • neutralizzazione in vitro
  • immunoglobuline
Data inizio appello
22/07/2016;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Gli anticorpi giocano un ruolo cruciale nei meccanismi di difesa nei confronti dei microrganismi patogeni extracellulari, tossine ed anche intracellulari, laddove gli anticorpi riescano a legare tali agenti patogeni prima della penetrazione nella cellula bersaglio. Le funzioni effettrici anticorpali sono molteplici e variano in base all’isotipo anticorpale (IgA, IgE, IgM, IgG). Oltre a numerosi funzioni, le immunoglobuline G, che rappresentano la classe maggiormente rappresentata nel sangue, mostrano la capacità di neutralizzazione: legandosi infatti agli antigeni questa classe anticorpale blocca (neutralizza) l’infettività dei microbi e l’interazione con le cellule dell’ospite. <br>Le tecniche di diagnosi sierologica delle infezioni virali includono il saggio di neutralizzazione in vitro caratterizzato dalla ricerca e titolazione di eventuali anticorpi neutralizzanti l’infettività virus specifica, il cui caratteristico effetto citopatico viene rilevato in colture cellulari. Lo stesso tipo di test è descritto nella United States Pharmacopea (USP) e richiesto come test di rilascio dalla Food and Drug Administration (FDA) per la categoria farmaceutica delle Immunoglobuline derivate da plasma umano per frazionamento.<br>Lo scopo del lavoro di tesi era quello di verificare la comparabilità di due protocolli di neutralizzazione applicati a siero di pazienti e concentrati di immunoglobuline di origine umana. Entrambi i protocolli sono applicati per la determinazione in vitro del titolo di anticorpi neutralizzanti diretti contro il virus del morbillo ed il virus polio, agente eziologico della poliomielite.<br>Un protocollo è applicato presso il laboratorio di virologia di un’azienda di servizi e consulenza con sede a Glasgow in Scozia. Si tratta di un’azienda certificata GMP ed FDA. Esso è applicato a concentrati di immunoglobuline di derivazione umana per la rivelazione di anticorpi neutralizzanti diretti contro il virus polio, sierotipo1-3, e virus del morbillo. I prodotti di immunoglobuline sono costituiti al 95% di IgG al tracciato elettroforetico ed una soluzione di maltosio come eccipiente. I prodotti sono liquidi e pronti all’uso e contengono un contenuto in immunoglobuline pari a circa 10 gr/100 ml.<br>Il secondo protocollo è stato implementato ed è attualmente applicato a scopo diagnostico presso il laboratorio di Virologia Universitaria dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana (AOUP); il saggio permette la titolazione di anticorpi neutralizzanti contro i virus Coxsackie, sierotipi 1-6, e Polio, sierotipi 1-3, in campioni di siero, liquido cefalo-rachidiano, pericardico e pleurico.<br>Dallo studio di entrambi i protocolli sono emerse differenze ritenute significative e da verificare come variabili non trascurabili per il risultato finale del test. I due metodi mostrano discrepanze nell’applicazione del metodo relative a: dose infettante (100 TCID50/ml vs 1000 TCID50/ml), substrato cellulare utilizzato (cellule KB vs cellule Vero), tempo di incubazione (1h vs 1h ½), tempo di lettura del CPE (5 giorni vs 6 giorni), layout di semina, metodo di determinazione del titolo (formula Reed Muench vs formula di Spearman).<br>La valutazione della comparabilità del metodo è stata eseguita riproducendo titolazioni e saggio di neutralizzazione del virus polio, sierotipo 1, 2 e 3 e del virus del morbillo applicando i protocolli a sieri di pazienti e concentrati di immunoglobuline. Preso atto della variabilità interseca del metodo di neutralizzazione, dovuta all’elevata manualità richiesta dal test e legata alla soggettività all’interpretazione dell’effetto citopatico, in particolare per quanto riguarda il virus del morbillo, i risultati mostrano come i due protocolli abbiano rilevato dati paragonabili e sovrapponibili per il poliovirus. Non è emersa alcuna differenza significativa (differenza non superiore ad una diluzione non è ritenuta significativa) nei titoli di anticorpi neutralizzanti contro poliovirus in letture eseguite dopo cinque o sei giorni di incubazione sia che si utilizzino cellule KB sia cellule Vero.<br>La titolazione del virus del morbillo, eseguita mediante l’utilizzo di entrambi i protocolli applicati alle cellule Vero, ha evidenziato come l’applicazione del protocollo del laboratorio di Glasgow abbia rilevato risultati del titolo virale mediamente più bassi sia applicando la formula di Reed Muench sia quella di Sperman. Si ritiene che questa variabilità sia attribuibile alla maggiore variabilità della risposta del virus del morbillo e alla sua lenta crescita, per il quale il saggio di neutralizzazione è risultato applicabile solo parzialmente. <br>Poiché il tempo di incubazione tra la soluzione di anticorpi e la sospensione degli antigeni risulta essere uno step cruciale al fine della neutralizzazione è stato verificato il tempo minimo applicabile per l’esecuzione del test che può variare, dai dati di letteratura, da un minimo di 30 minuti a 37°C fino a 2 ore a temperatura ambiente. Questo aspetto è stato verificato applicando il protocollo del laboratorio AOUP a due lotti di concentrati di immunoglobuline per verificare se l’elevata concentrazione anticorpale contro polio 1, 2 e 3 potesse incidere sul tempo di incubazione richiesto per la determinazione del titolo finale; sono stati considerati tre tempi di incubazione (tempo di 30 minuti, tempo di 1 ora e di 1 ora e 30 minuti): dai risultati emersi si nota come il maggiore delta tra i titoli anticorpali non è risultato superiore ad un logaritmo in tutti i tre tempi; per tale ragione il tempo di incubazione di un’ora a 37°C come previsto dal protocollo del laboratorio dell’AOUP è sovrapponibile a quello utilizzato nel protocollo del laboratorio di Glasgow. <br>Il saggio di neutralizzazione secondo il protocollo del laboratorio AOUP è stato inoltre eseguito su otto lotti di immunoglobuline al fine di valutare la comparabilità dei risultati: per tutti i lotti è emerso che i rispettivi titoli anticorpali, ottenuti con il protocollo del laboratorio esterno, sono risultati tendenzialmente più bassi rispetto all’atteso, sebbene non in modo significativo, sia utilizzando la formula di calcolo di Reed Muench sia la formula di Sperman confermando che il protocollo per il test di neutralizzazione in vitro implementato dal laboratorio dell’AOUP risulta sovrapponibile al metodo utilizzato presso il laboratorio GMP e approvato dall’FDA.
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