• rischio idrico
• legionella
• suscettibilità cloro
• infettività intracellulare

L’acqua erogata nelle strutture sanitarie può essere veicolo di trasmissione di microrganismi potenzialmente patogeni e Legionella spp. rappresenta un paradigma nella gestione del rischio idrico perché ubiquitario negli ambienti acquatici naturali e artificiali, intrinsecamente resistente a procedure di bonifica e agente eziologico di una patologia grave ad elevata letalità. Molteplici fattori di stress quali la carenza di nutrienti, la temperatura, la clorazione dell’acqua, possono indurre la permanenza di Legionella spp. all’interno delle amebe, loro ospiti naturali, che proteggono i microrganismi dall’attività battericida dei comuni disinfettanti e ne garantiscono la persistenza nella rete. Le evidenze scientifiche dimostrano oramai che l’eradicazione di Legionella spp. è impossibile ed è quindi necessario adottare una corretta gestione del rischio per tenere sotto controllo la colonizzazione delle rete.
Scopo di questa tesi è stata la valutazione della strategia proattiva applicata da oltre otto anni in un ospedale di alta specializzazione, strategia che ha previsto l’adozione di un sistema integrato di disinfezione-filtrazione, scelto in funzione di una stratificazione del rischio per livello di contaminazione microbica e tipologia di paziente, e verificato mediante una continua sorveglianza ambientale. A tal fine è stato analizzato l’effetto degli interventi di bonifica sull’ecologia microbica della rete idrica ospedaliera, attraverso la tipizzazione molecolare degli isolati e lo studio della loro distribuzione spazio-temporale. Inoltre è stato verificato se l’espressione di alcuni geni di virulenza, implicati nell’internalizzazione in cellule ospiti, potesse essere regolata dall’esposizione al cloro e se questa induzione sia in grado di regolare la cinetica di moltiplicazione di Legionella in Acanthamoeba polyphaga.
Ceppi rappresentativi di Legionella pneumophila sg 1 sono stati sottoposti a tipizzazione genetica attraverso l’elettroforesi in campo pulsato (Pulse Field Gel Electrophoresis) e sequenziamento allelico (Sequence Base Typing) di sette loci di riferimento (mip, flaA, pilE, asd, mompS, proA, neuA). Le prove di suscettibilità all’attività battericida del cloro sono state effettuate in accordo alla norma BS EN 1040:1997, su ceppi isolati sia prima che dopo l’adozione della clorazione in continuo. I livelli di espressione delle regioni codificanti il sistema di secrezione di tipo IVA (locus lvh), i prodotti del gene mip (macrophage infectivity potentiator) e del gene rtxA (repeat in toxin) sono stati studiati mediante un’analisi quantitativa relativa, con il metodo del 2-∆∆Ct. Infine la variazione della virulenza è stata valutata anche attraverso co-colture di Legionella pneumophila in Acanthamoeba polyphaga.
A seguito degli interventi di bonifica è stata rilevata una significativa riduzione della percentuale di siti positivi e della carica microbica nel corso degli anni di monitoraggio, ma le indagini molecolari hanno evidenziato la persistenza di tre cloni di L. pneumophila la cui distribuzione ambientale è cambiata negli anni successivi all’applicazione del piano per la gestione del rischio. L’analisi dei profili d’espressione ha indicato che il gene mip è espresso precocemente e 3,5 volte in più nei ceppi isolati dopo gli interventi di bonifica rispetto ai cloni pre-bonifica. Analogamente le regioni codificanti il sistema di secrezione di tipo IVA (locus lvh) sono espresse da 1,6 a 3,2 volte in più nei ceppi post-clorazione. Un diverso andamento è stato osservato per la regione rtxA espressa tardivamente e 2,3 volte in più nei ceppi pre-clorazione.
Le prove di co-coltura in A. polyphaga hanno rilevato una differente capacità dei cloni di L. pneumophila di infettare l’ospite, in particolare i ceppi isolati dopo l’inizio della clorazione in continuo della rete idrica hanno mostrano una più rapida cinetica di replicazione, confermando il ruolo del disinfettante in rete quale attivatore dei caratteri di virulenza.
Dai risultati emerge che i ceppi isolati dopo l’introduzione della clorazione in continuo sembrano sviluppare una risposta adattativa alla disinfezione, mediante l’acquisizione di tratti associati ad una maggiore virulenza. L’applicazione di un piano per la gestione del rischio idrico dovrebbe quindi considerare la possibilità di modificare a lungo termine l’ecologia microbica e pertanto, avvalendosi di una sorveglianza molecolare, poter pianificare interventi di controllo appropriati.