• interattori
• two-hybrid
• Xotx5b

La specificazione ed il differenziamento dei diversi tipi cellulari retinici sono regolati dall’espressione sequenziale e cellulo-specifica di specifici set di geni. I geni Otx, ortologhi del gene di Drosophila orthodenticle (otd), svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo del sistema nervoso anteriore dei vertebrati. In particolare, in Xenopus laevis, le due omeoproteine Xotx2 e Xotx5 sono importanti per determinare il destino bipolare o fotorecettoriale delle cellule retiniche: l’azione di Xotx2 porta ad un destino bipolare, mentre l’espresione di Xotx5 porta ad un destino di tipo fotorecettoriale. Studi precedenti svolti nel nostro laboratorio hanno dimostrato come una breve sequenza amminoacidica, localizzata direttamente a valle dell’omeodominio e denominata “retinal specificity box”, sia necessaria e sufficiente per conferire ai due prodotti proteici le loro attività differenziali nello sviluppo della retina di Xenopus laevis. Una delle ipotesi formulate è che le due omeoproteine debbano la loro diversa attività differenziale all’interazione con cofattori diversi che ne determinano la specificità di azione retinica. Lo scopo del mio progetto di tesi è stato quello di individuare potenziali interattori della omeoproteina Xotx5. Per individuare potenziali interattori della omeoproteina Xotx5 abbiamo effettuato uno screening di una library di cDNA di Xenopus laevis, con il metodo del doppio ibrido. Il protocollo two hybrid permette di ottenere una crescita differenziale su terreno selettivo delle sole cellule di lievito in cui si verifichi interazione tra i prodotti dei geni esca e preda. Nel nostro caso l’esca è costituita da un frammento del gene Xotx5, comprendente sia l’omeodominio sia la “specificity box”, clonato nel vettore plasmidico pGBDU, mentre la library di prede è costituita da frammenti di cDNA inseriti nel vettore plasmidico pVP16(f1). Dallo screening iniziale abbiamo ottenuto 128 cloni indipendenti, che sono poi stati tutti ritestati mediante una nuova trasformazione secondo il protocollo two hybrid. Di questi, 15 sono risultati effettivamente positivi. I cloni positivi ottenuti dallo screening con Xotx5 sono stati anche saggiati per l’interazione con Xotx2, di nuovo utilizzando il sistema two hybrid, utilizzando come esca un frammento di Xotx2 corrispondente al frammento impiegato per lo screening con Xotx5. I 15 cloni positivi sono stati sequenziati, le sequenze nucleotidiche ottenute e le corrispondenti sequenze proteiche predette sono state confrontate con i database, alla ricerca di omologie con sequenze già descritte. Attualmente, stiamo clonando i 15 frammenti ottenuti dallo screening nel vettore plasmidico pBluescript, allo scopo di produrre sonde con digossigenina per ciascuna di esse, per poter poi effettuare una serie di ibridazioni in situ con ciascuna sonda ai diversi stadi di sviluppo embrionale.