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Tesi etd-06292006-113248


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
Cerri, Chiara
email address
chiaracerri1@virgilio.it
URN
etd-06292006-113248
Title
L'azione delle neurotossine botuliniche nel Sistema Nervoso Centrale: effetto neuroprotettivo di BoNT/E in un modello di ischemia cerebrale focale.
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Commissione
Relatore Caleo, Matteo
Relatore Prof. Vignali, Robert
Parole chiave
  • SNAP 25
  • glutammato
  • kainato
Data inizio appello
17/07/2006;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
17/07/2046
Riassunto analitico
<br>Le neurotossine botuliniche (BoNT) sono endopeptidasi prodotte dai batteri del genere Clostridium che esercitano un&#39;azione proteolitica altamente selettiva su molecole del complesso SNARE, proteine di membrana implicate nel processo di rilascio del neurotrasmettitore alla terminazione presinaptica. Il taglio proteolitico rende inattive le SNARE e determina il blocco della trasmissione sinaptica.<br>L’azione delle tossine è stata ampiamente caratterizzata a livello del sistema nervoso periferico.<br>A livello di placca motrice bloccano il rilascio di acetilcolina causando paralisi neuromuscolare. Meno si conosce sull’azione delle BoNT nel sistema nervoso centrale. <br>Nel mio lavoro di tesi abbiamo valutato gli effetti in vivo delle neurotossine nel sistema nervoso centrale. In particolare abbiamo studiato l’azione dei serotipi A ed E (BoNT/A e BoNT/E) a livello dell’ippocampo dei roditori.<br>BoNT/A e BoNT/E esercitano la loro attività proteolitica sulla stessa proteina del complesso SNARE, la proteina associata ai sinaptosomi dal peso di 25 KDa (SNAP-25), localizzata preferenzialmente nei terminali glutammatergici. Studi in vitro mostrano infatti che sono in grado di inibire reversibilmente il rilascio di glutammato. <br>Abbiamo effettuato un’ iniezione unilaterale e stereotassica della BoNT/E o della BoNT/A nell’ippocampo dorsale di topo adulto e ne abbiamo valutato gli effetti a livello elettrofisiologico e biochimico. <br>Le registrazioni in vivo di potenziali d’azione dall’ippocampo mostrano che entrambi i serotipi determinano un silenziamento dell’attività di scarica spontanea dei neuroni piramidali. Tuttavia la durata di quest’effetto inibitorio persiste per periodi diversi: il silenziamento indotto da BoNT/A dura per almeno 60 giorni mentre quello determinato da BoNT/E, meno di 14 giorni. Questi dati elettrofisiologici sono confermati da analisi di espressione di SNAP-25 tagliata tramite Western blot. Esperimenti di immunoistochimica mostrano una localizzazione similare delle due forme di SNAP-25 tagliata da BoNT/A o da BoNT/E. Tuttavia a partire dal terzo giorno dall’iniezione si rivela la marcatura per SNAP-25 tagliata da BoNT/A anche nell’ippocampo controlaterale, soprattutto a livello della CA3. Questo dato viene supportato dagli esperimenti di western blot che confermano la diffusione dell’azione proteolitica di BoNT/A anche nell’emisfero non iniettato. <br> È noto che, nel sistema nervoso periferico, l’azione delle BoNT è attività dipendente: è stato osservato che la paralisi indotta dalla somministrazione di BoNT/A avviene più efficacemente se il terminale nervoso viene stimolato ad alta frequenza. Abbiamo quindi voluto verificare se l’azione di BoNT/E fosse attività-dipendente nel sistema nervoso centrale. Per far questo abbiamo valutato l’attività proteolitica di BoNT/E in una situazione di aumentata attività elettrica cerebrale, causata dalla somministrazione intraippocampale di KA, un agonista del glutammato, nel ratto adulto.<br>I risultati preliminari ottenuti dimostrano una diminuzione paradossale dell&#39;attività proteolitica di BoNT/E negli animali trattati con kainato rispetto ai controlli. <br>Abbiamo infine esaminato il possibile effetto neuroprotettivo della BoNT/E in un modello di ischemia cerebrale focale nel ratto.<br>L’ischemia cerebrale è una delle patologie neurologiche più diffuse e si verifica quando viene interrotto il flusso sanguigno in una porzione dell’encefalo. L’ischemia causa la morte dei neuroni ipossici con formazione di un’area di necrosi (core ischemico) e di una penombra perilisionale in cui la degenerazione avviene, almeno in parte, con meccanismi attivi (apoptosi). La nostra ipotesi è che la degenerazione neuronale sia innescata dall’eccessivo rilascio di glutammato dai neuroni danneggiati. <br>Il modello di ischemia focale da noi utilizzato, si basa sulla microiniezione di un potente vasocostrittore, l’endotelina-1 (ET-1), nella regione CA1 dell’ippocampo di ratti adulti.<br>Gli animali hanno ricevuto dapprima ET-1 e circa 20 minuti dopo BoNT/E o la soluzione di controllo e sono stati perfusi con paraformaldeide dopo 24 ore o dopo un mese dall’iniezione.<br>L’analisi stereologica su sezioni istologiche trattate mediante colorazione di Nissl, ha rivelato una netta riduzione nell’ estensione del danno negli animali trattati con BoNT/E rispetto ai controlli.<br>Da questi risultati si può concludere che la BoNT/E previene la morte neuronale in questo modello di ischemia cerebrale focale.<br>
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