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Tesi etd-06292006-113248


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
Cerri, Chiara
email address
chiaracerri1@virgilio.it
URN
etd-06292006-113248
Title
L'azione delle neurotossine botuliniche nel Sistema Nervoso Centrale: effetto neuroprotettivo di BoNT/E in un modello di ischemia cerebrale focale.
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Supervisors
Relatore Caleo, Matteo
Relatore Prof. Vignali, Robert
Parole chiave
  • SNAP 25
  • glutammato
  • kainato
Data inizio appello
17/07/2006;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
17/07/2046
Riassunto analitico

Le neurotossine botuliniche (BoNT) sono endopeptidasi prodotte dai batteri del genere Clostridium che esercitano un'azione proteolitica altamente selettiva su molecole del complesso SNARE, proteine di membrana implicate nel processo di rilascio del neurotrasmettitore alla terminazione presinaptica. Il taglio proteolitico rende inattive le SNARE e determina il blocco della trasmissione sinaptica.
L’azione delle tossine è stata ampiamente caratterizzata a livello del sistema nervoso periferico.
A livello di placca motrice bloccano il rilascio di acetilcolina causando paralisi neuromuscolare. Meno si conosce sull’azione delle BoNT nel sistema nervoso centrale.
Nel mio lavoro di tesi abbiamo valutato gli effetti in vivo delle neurotossine nel sistema nervoso centrale. In particolare abbiamo studiato l’azione dei serotipi A ed E (BoNT/A e BoNT/E) a livello dell’ippocampo dei roditori.
BoNT/A e BoNT/E esercitano la loro attività proteolitica sulla stessa proteina del complesso SNARE, la proteina associata ai sinaptosomi dal peso di 25 KDa (SNAP-25), localizzata preferenzialmente nei terminali glutammatergici. Studi in vitro mostrano infatti che sono in grado di inibire reversibilmente il rilascio di glutammato.
Abbiamo effettuato un’ iniezione unilaterale e stereotassica della BoNT/E o della BoNT/A nell’ippocampo dorsale di topo adulto e ne abbiamo valutato gli effetti a livello elettrofisiologico e biochimico.
Le registrazioni in vivo di potenziali d’azione dall’ippocampo mostrano che entrambi i serotipi determinano un silenziamento dell’attività di scarica spontanea dei neuroni piramidali. Tuttavia la durata di quest’effetto inibitorio persiste per periodi diversi: il silenziamento indotto da BoNT/A dura per almeno 60 giorni mentre quello determinato da BoNT/E, meno di 14 giorni. Questi dati elettrofisiologici sono confermati da analisi di espressione di SNAP-25 tagliata tramite Western blot. Esperimenti di immunoistochimica mostrano una localizzazione similare delle due forme di SNAP-25 tagliata da BoNT/A o da BoNT/E. Tuttavia a partire dal terzo giorno dall’iniezione si rivela la marcatura per SNAP-25 tagliata da BoNT/A anche nell’ippocampo controlaterale, soprattutto a livello della CA3. Questo dato viene supportato dagli esperimenti di western blot che confermano la diffusione dell’azione proteolitica di BoNT/A anche nell’emisfero non iniettato.
È noto che, nel sistema nervoso periferico, l’azione delle BoNT è attività dipendente: è stato osservato che la paralisi indotta dalla somministrazione di BoNT/A avviene più efficacemente se il terminale nervoso viene stimolato ad alta frequenza. Abbiamo quindi voluto verificare se l’azione di BoNT/E fosse attività-dipendente nel sistema nervoso centrale. Per far questo abbiamo valutato l’attività proteolitica di BoNT/E in una situazione di aumentata attività elettrica cerebrale, causata dalla somministrazione intraippocampale di KA, un agonista del glutammato, nel ratto adulto.
I risultati preliminari ottenuti dimostrano una diminuzione paradossale dell'attività proteolitica di BoNT/E negli animali trattati con kainato rispetto ai controlli.
Abbiamo infine esaminato il possibile effetto neuroprotettivo della BoNT/E in un modello di ischemia cerebrale focale nel ratto.
L’ischemia cerebrale è una delle patologie neurologiche più diffuse e si verifica quando viene interrotto il flusso sanguigno in una porzione dell’encefalo. L’ischemia causa la morte dei neuroni ipossici con formazione di un’area di necrosi (core ischemico) e di una penombra perilisionale in cui la degenerazione avviene, almeno in parte, con meccanismi attivi (apoptosi). La nostra ipotesi è che la degenerazione neuronale sia innescata dall’eccessivo rilascio di glutammato dai neuroni danneggiati.
Il modello di ischemia focale da noi utilizzato, si basa sulla microiniezione di un potente vasocostrittore, l’endotelina-1 (ET-1), nella regione CA1 dell’ippocampo di ratti adulti.
Gli animali hanno ricevuto dapprima ET-1 e circa 20 minuti dopo BoNT/E o la soluzione di controllo e sono stati perfusi con paraformaldeide dopo 24 ore o dopo un mese dall’iniezione.
L’analisi stereologica su sezioni istologiche trattate mediante colorazione di Nissl, ha rivelato una netta riduzione nell’ estensione del danno negli animali trattati con BoNT/E rispetto ai controlli.
Da questi risultati si può concludere che la BoNT/E previene la morte neuronale in questo modello di ischemia cerebrale focale.
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