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Il cancro del colon-retto è una neoplasia di frequente riscontro a livello globale; se precocemente diagnosticato, le probabilità di guarigione sono molto elevate, mentre i pazienti con cancro colorettale metastatico (mCCR) presentano prospettive di cura molto più limitate, nelle quali hanno un ruolo prioritario l’operabilità delle lesioni e la terapia sistemica con chemioterapici e farmaci biologici per il controllo della malattia e l’allungamento della sopravvivenza.
Quando possibile, la resezione chirurgica è l’unica chance di cura in un sottogruppo di pazienti selezionati con tumore del colon-retto e metastasi limitate al fegato (LL-mCCR). L’avanzamento delle tecniche chirurgiche, la disponibilità di trattamenti sistemici più attivi e gli approcci multidisciplinari hanno consentito di espandere la percentuale di pazienti con LL-mCCR sottoposti a chirurgia con intento curativo. Tuttavia, in questo setting, la maggior parte delle recidive di malattia, dovute alla presenza di malattia minima residua (Minimal Residual Disease – MRD) non evidenziabile alle indagini radiologiche post-operatorie, si verifica entro i primi tre anni dopo la resezione con tassi di recidiva a 3 anni fino al 60%-80%.
Ad oggi, sono ancora sconosciute caratteristiche cliniche convalidate o biomarcatori molecolari in grado di identificare pazienti ad alto rischio di recidiva dopo resezione curativa. Inoltre, un problema di enorme impatto clinico è l’inadeguatezza dei programmi di follow-up successivi alla chirurgia nel cogliere precocemente la recidiva di malattia in questo sottogruppo di pazienti.
La possibilità di rilevare la presenza di MRD post-chirurgica permetterebbe di selezionare adeguatamente i pazienti sulla base del rischio di recidiva di malattia, fornendo all’oncologo un importante strumento per individuare quali pazienti potrebbero beneficiare maggiormente di un trattamento chemioterapico post-operatorio ed eventualmente di un programma di follow-up radiologico post-operatorio più intensivo.
In questo contesto assume rilevanza la biopsia liquida, che offre la possibilità di analizzare i fattori circolanti derivati dal tumore, tra cui il circulating tumour DNA (ctDNA), una frazione libera di DNA tumorale, caratterizzato da alterazioni tumore-specifiche, ricercabile su campioni plasmatici dei pazienti.
Questa promettente applicazione della biopsia liquida, mediante la rilevazione di ctDNA, consentirebbe di studiare la presenza di MRD e la probabilità di recidiva della malattia nei pazienti sottoposti a resezione radicale del tumore.
Diversi studi hanno analizzato il ruolo prognostico del ctDNA e la sua correlazione con la sopravvivenza libera da recidiva (RFS) in pazienti affetti da tumore del colon-retto resecato, dimostrando un tasso di recidiva più elevato ed una RFS più breve nei pazienti positivi per la presenza di ctDNA rispetto ai pazienti ctDNA negativi.
Negli studi a nostra disposizione i saggi maggiormente utilizzati per l’analisi del ctDNA sono I) la PCR digitale personalizzata (ddPCR), test economico e veloce da eseguire ma limitato dal rilevamento di un piccolo numero di mutazioni geniche e non in grado di rilevare mutazioni non note a priori; o II) le nuove metodiche di next generation sequencing (NGS), che consentono di individuare in una singola analisi un pannello più ampio di geni.
L’attuale paradigma divide le strategie utilizzate in: 1) approccio tumour-informed, in cui alterazioni molecolari precedentemente identificate nel tessuto tumorale sono utilizzate come marcatori per rilevare il ctDNA plasmatico o 2) strategia tumour-uninformed, dedicata all’analisi diretta sul plasma ricercando le mutazioni presenti senza avere la guida delle mutazioni del tessuto tumorale.
Il primo approccio riduce sicuramente i falsi positivi, limitando l’errore di considerare di pertinenza del tumore mutazioni non tumorali, ma tuttavia allunga i tempi dovendo eseguire l’analisi iniziale sul tessuto tumorale e non consente di rilevare l’eterogenicità tumorale.
Tuttavia, nonostante il ruolo rivoluzionario che la biopsia liquida avrà nella gestione dei pazienti oncologici, il suo uso routinario nella patologia colorettale è messo in discussione dalla sensibilità non ottimale dei test disponibili relativa a concentrazioni molto basse di ctDNA nei campioni plasmatici e dalla mancanza attuale di una metodica validata e standardizzata per analizzare le mutazioni tumorali specifiche presenti nel ctDNA.
Sulla base di queste considerazioni, il rilevamento di MRD può anche avere un'applicazione importante nei pazienti resecati con LL-mCCR al fine di definire i pazienti che sono veramente guariti con un intervento chirurgico da quelli che hanno un rischio maggiore di recidiva futura.
Questo lavoro di tesi mira a valutare il ruolo prognostico del ctDNA postoperatorio in termini di RFS in pazienti con LL-mCCR sottoposti a resezione curativa delle metastasi epatiche ed a confrontare i risultati ottenuti con l'analisi del ctDNA mediante ddPCR basata sulla caratterizzazione molecolare del tessuto (coorte 1) con i risultati ottenuti da una strategia tumour-uninformed mediante analisi NGS (coorte 2).
I criteri di inclusione della coorte 1 erano i seguenti: diagnosi istologica di LL-mCCR radicalmente resecato, nessuna evidenza di malattia alla TC post-operatoria (svolta entro 30 giorni dall’intervento chirurgico), disponibilità di campioni di plasma prelevati entro 60 giorni dalla chirurgia (e prima dello svolgimento di eventuale terapia adiuvante) e disponibilità dello status delle alterazioni geniche su campioni istologici di tessuto tumorale.
I pazienti erano considerati ctDNA + se la stessa mutazione ottenuta sul tessuto veniva riscontrata anche nel plasma raccolto a seguito della chirurgia.
All’interno della coorte 1 sono stati inclusi 76 pazienti con LL-mCCR sottoposti a chirurgia curativa. Di questi pazienti, in 39 è stata rilevata la presenza di ctDNA (pazienti ctDNA+) e 37 pazienti sono stati classificati ctDNA-. Dopo un follow-up mediano di 77 mesi, 33 dei 39 soggetti ctDNA+ e 20 dei 37 soggetti ctDNA- sono andati incontro a recidiva, e la nostra analisi dimostra che coloro che erano ctDNA+ avevano un rischio significativamente più alto di sviluppare recidiva (85% vs 54%, p=0,008).
La ddPCR ha mostrato una sensibilità del 62,3%, una specificità del 73,9%, un valore predittivo positivo (VPP) del 84,6% e un valore predittivo negativo (VPN) del 46%. Con riferimento all’endpoint primario dello studio, nella coorte 1, il gruppo di pazienti ctDNA+ otteneva RFS inferiori rispetto al gruppo ctDNA - con una differenza statisticamente significativa. In particolare, la RFS mediana per i pazienti ctDNA+ era di 12,7 mesi versus 27,4 mesi per i ctDNA- (HR= 2.09; 95%CI, 1.20-3.66; p=0.008). Anche all’analisi univariata e multivariata lo status positivo del ctDNA postoperatorio resta correlato ad una RFS minore. Tra gli endpoints secondari, abbiamo valutato l’overall survival (OS) post-operatoria, dimostrando che nel gruppo ctDNA + è risultata minore rispetto a quella dei pazienti negativi, seppur non si raggiunga una significatività statistica. In particolare, la OS post-operatoria mediana è stata di 78.8 mesi per i soggetti ctDNA+ versus una OS non raggiunta per i soggetti ctDNA- (HR 1.65; 95% CI, 0.78–3.47; p=0.183).
Nella parte successiva di questa tesi ci si è concentrati sull’analisi della correlazione tra RFS con lo status del ctDNA, utilizzando però una strategia tumor-uninformed basata sull’analisi del campione plasmatico tramite saggio NGS che analizzava un ampio pannello di geni specifici per il cancro colorettale, considerando ctDNA+ i pazienti che presentassero almeno una mutazione.
All’interno della coorte 2 sono stati inclusi 54 pazienti con LL-mCCR sottoposti a chirurgia curativa. I criteri di inclusione erano simili ai precedenti: diagnosi istologica di LL-mCCR radicalmente resecato, nessuna evidenza di malattia alla TC post-operatoria (svolta entro 30 giorni dall’intervento chirurgico). Nei pazienti candidati a chemioterapia adiuvante i campioni di plasma sono stati ottenuti prima del suo inizio, al fine di evitare eventuali effetti confondenti.
Il ctDNA è stato rilevato in 17 (31,5%) su 54 campioni. Durante il follow- up mediano di 70 mesi, 14 dei 17 soggetti ctDNA+ (82%) e 21 dei 37 soggetti ctDNA- (57%) sono andati incontro a recidiva e si è visto che coloro che erano ctDNA+ avevano un rischio numericamente più alto di sviluppare recidiva (82% vs 57%, p=0,123), ma in assenza di una differenza statisticamente significativa tra i due gruppi. La tecnologia NGS per la ricerca di mutazioni in modalità tumor-uninformed ha mostrato una sensibilità del 40%, una specificità del 84%, e un VPP e un VPN rispettivamente del 82% e 43%.
In termini di endpoint primario, anche per la coorte 2, la rilevazione di ctDNA postoperatorio era associata a RFS significativamente minore: la mediana di RFS per i pazienti ctDNA+ era di 9,08 mesi versus 27,4 mesi per i ctDNA- (HR 2.82; 95% CI, 1.21–6.55; p=0.015). Il valore prognostico del ctDNA si conferma anche nelle analisi uni e multivariate relative alla coorte 2.
Con riferimento all’endpoint secondario di OS post-operatoria, abbiamo dimostrato che il gruppo ctDNA+ raggiunge OS post-operatorie significativamente minori rispetto ai soggetti ctDNA-, vediamo infatti come la OS mediana è stata di 80.4 mesi per i soggetti ctDNA- contro una OS di 51.9 mesi per i soggetti ctDNA+ (HR 2.86; 95% CI, 1.10–7.41; p=0.007).
In definitiva, quindi, è possibile notare come le strategie di rilevazione del ctDNA siano correlate in entrambi i casi alla RFS, confermando il potenziale ruolo prognostico negativo del ctDNA nei pazienti con LL-mCCR radicalmente operati.
Nonostante non sia possibile un confronto statistico formale tra i test e le metodiche utilizzate, essendo i pazienti differenti, è possibile comunque notare come la strategia tumour-infomed abbia una buona sensibilità e specificità ed utilizzando la ddPCR, più economica e rapida nell’esecuzione rispetto alle strategie di NGS, potrebbe essere preferita come metodica di analisi postoperatoria nella routine clinica come strumento di selezione dei pazienti.