• NF-E2-related factor 2
• Malattia di Parkinson
• biomarcatori
• stress ossidativo

La malattia di Parkinson (MP) colpisce oltre l'1% della popolazione oltre i 60 anni di età ed è la seconda malattia neurodegenerativa più comune dopo la Malattia di Alzheimer (AD). La maggior parte dei pazienti presenta la forma sporadica della MP (90%), mentre il 10% degli individui affetti ha una storia familiare di malattia. La MP è causata dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici all'interno della pars compacta della sostanza nera (SNpc). La MP è una patologia complessa e multifattoriale, la cui patogenesi non è ancora del tutto chiara e per la quale sono state proposte diverse teorie. Tra le diverse ipotesi avanzate, quella che chiama in causa le disfunzioni mitocondriali e lo stress ossidativo (OS) sembra una delle più accreditate. In particolare, i difetti mitocondriali portano ad alterazioni di energia e produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e quindi ad alterazioni del bilancio bioenergetico. Prove consistenti provenienti da studi sia genetici che epidemiologici mostrano un forte coinvolgimento delle disfunzioni mitocondriali e dell’OS nella patogenesi e nella progressione della malattia. I geni come PARK2, PARK6 e PARK7 che codificano, rispettivamente, per Parkin, PINK1 e DJ-1 sono associati a forme familiari di MP a esordio precoce e le mutazioni in tutti questi geni influenzano la funzione mitocondriale causando la morte neuronale (Kieburtz e Wunderle, 2013; Trinh e Farrer, 2013). Studi epidemiologici e su modelli animali dimostrano che le tossine ambientali e i pesticidi che inibiscono il complesso mitocondriale I, come l'1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) (Langston et al, 1983) e il rotenone, sono responsabili del disequilibrio bioenergetico e, quindi, dell’aumento della produzione delle ROS e dell’OS, causando infine la perdita di neuroni dopaminergici nel SNpc. Inoltre, in studi post mortem condotti su tessuto cerebrale di pazienti affetti da MP, è emersa una più alta concentrazione di marcatori di OS rispetto a tessuti di controllo (Trachootham et al., 2008); tali dati sono stati confermati da ulteriori studi condotti in vivo su cellule e fluidi biologici periferici (Taylor JM, Main BS, Crack PJ.,2013; Duke DC, MoraN LB, Pearce RK, Graeber MB., 2007; Stojkovska I, Wagner BM, Morrison BE., 2015). Alla luce di questi dati, la comunità scientifica ha rivolto il suo interesse verso lo OS, indicandolo come un fattore importante nella patogenesi della MP. L’organismo umano, al fine di neutralizzare le ROS, ha sviluppato una pletora di meccanismi di difesa (Lee et al., 2005; Sykiotis e Bohmann, 2010). Inoltre, diversi studi hanno dimostrato che l'attivazione dell'espressione dei geni antiossidanti, in particolare quelli sotto il controllo del sistema Nfe2l2 / ARE, ha effetti neuroprotettivi in diversi modelli animali di MP. La via mediata dal fattore di trascrizione Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nfe2l2), noto anche come Nfe2l2, è attualmente riconosciuta come uno dei principali pathway di difesa cellulare contro lo stress indotto sia da sostanze pro-ossidanti che xenobiotiche (Dinková-Kostova e Ambramov, 2015). Nfe2l2, tramite il legame ad una specifica sequenza nucleotidica chiamata Antioxidant Response Element (ARE), modula l’attivazione trascrizionale dei suoi geni bersaglio (Dinková-Kostova e Ambramov, 2015); tra questi si annoverano geni che codificano per enzimi antiossidanti e per enzimi di detossificazione di fase II (Kundu e Surh, 2008). Il coinvolgimento di Nfe2l2 nell’espressione, sia basale che inducibile, dei geni ARE-dipendenti lo rende il principale regolatore della risposta antiossidante e un modulatore di numerosi processi, quali la risposta immunitaria ed infiammatoria, il rimodellamento tissutale e la proliferazione cellulare (Hyberston et al., 2011). Nfe2l2 appartiene alla famiglia dei fattori di trascrizione Cap'n'collar (Cnc) ed è considerato il "regolatore principale" della risposta antiossidante poiché modula l'espressione e l'induzione di una serie di geni difensivi che codificano per gli enzimi detossificanti di fase II e per le proteine antiossidanti, come il NAD (P) H: chinino ossidoreduttasi (NQO), eme ossigenasi-1 (HO-1), la glutatione S-transferasi (GST), proteine associate a resistenza multipla (Mrps), la famiglia UDP-glucuronosiltransferasi (UGT), proteine ferritiniche, la cicloossigenasi-2 (COX-2) e l’ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) (Kundu e Surh, 2008). Nfe2l2 è una proteina molto instabile, tipicamente presente in associazione con il suo regolatore negativo, Kelch-like erythroid-cell-derived protein with CNC homology (ECH)-associated protein 1 (Keap1) che agisce, a livello citoplasmatico, come un sensore molecolare del disturbo dell'omeostasi redox cellulare. In condizioni basali, Keap1 lega Nfe2l2 inattivandolo e , collegando questo fattore trascrizionale al citoscheletro di actina e guidandone la degradazione. In particolare, Keap1 agisce come una proteina di legame tra Nfe2l2 e il complesso di ligasi E3-ubiquitina, promuovendo l'ubiquitinazione di Nfe2l2 e la sua degradazione da parte del proteasoma 26S (Zhang et al., 2004). In condizioni di stress ossidativo, Keap1 subisce dei cambi conformazionali che causano il rilascio di Nfe2l2, che tramite sistemi proteici di trasporto va nel nucleo. All’interno del compartimento nucleare, Nfe2l2 si lega alle sequenze ARE di specifici geni bersaglio inducendone la trascrizione. Sono stati identificati, nella regione del promotore di NFE2L2, tre polimorfismi funzionali a singolo nucleotide (SNPs), -653A>G (rs3565212) -651G>A (rs6706649) e -617C>A (rs6721961), in grado di modulare l’espressione e la funzione del gene stesso (Marzec et al., 2007). Diverse evidenze in letteratura hanno dimostrato l’implicazione di Nfe2l2 in molti meccanismi patogenetici coinvolti nella neurodegenerazione (Johnson et al., 2010 (a); Pareek et al., 2011; Stack et al., 2010; Kim et al., 2013; Lou et al., 2014; Sarlette et al, 2008; Tanji et al., 2013; Bergstrom et al. 2014; Vargas et al., 2008). In particolare, è stata riportata un’associazione fra l’aplotipo GAGCAAAA, contenente i tre alleli comuni in corrispondenza dei siti polimorfici -653A>G, -651G>A e -651C>A, ed un ritardo di 4.6 anni nell’insorgenza della MP, sia in una popolazione svedese che in una polacca; successivamente, gli stessi autori in uno studio di meta-analisi, esteso a pazienti italiani, maltesi e tedeschi, hanno individuato quattro singoli SNPs associati con l’età di insorgenza della malattia; in particolare, la variante allelica -653G anticipa l’esordio della MP di 1.1 anni.
In base a tali presupposti, lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare una possibile associazione tra i polimorfismi -653 A>G, -651 G>A e -617 C>A, presenti nel promotore del gene NFE2L2, e il rischio di insorgenza di MP e la loro possibile implicazione nei meccanismi molecolari che sono alla base della risposta allo stress ossidativo. A tal fine abbiamo valutato:
• la distribuzione delle frequenze alleliche e genotipiche dei tre polimorfismi funzionali -653 A>G, -651 G>A e -617 C>A in 172 pazienti MP e 187 controlli sani; la genotipizzazione è stata condotta mediante sequenziamento automatico diretto della regione di DNA di interesse.
• l’eventuale associazione dei polimorfismi funzionali presenti nel promotore con le caratteristiche cliniche dei pazienti.
• i livelli plasmatici di alcuni biomarcatori di stress ossidativo in 47 pazienti e 68 controlli, determinati tramite metodi spettrofotometrici. Come marker di danno ossidativo, sono stati dosati i Prodotti di Ossidazione Avanzata alle Proteine (AOPP) e, come markers antiossidanti non enzimatici, la Capacità Antiossidante Ferro Riducente (FRAP) e i gruppi tiolici totali plasmatici (-SH).
• I livelli di trascrizione del gene NFE2L2 in un sottogruppo di 15 pazienti.

Le analisi relative al dosaggio dei marcatori di stress ossidativo e mRNA sono stati eseguiti su campioni ematici raccolti al momento della diagnosi, in modo da eliminare fattori confondenti, quali le terapie farmacologiche.
L'analisi dei dati sulla popolazione MP mostra che la variante allelica -653G è associata ad un aumentato rischio di malattia (0.38 vs 0.24, p<0,05); la frequenza dei soggetti eterozigoti -653AG (p<0,001) così come quella dei G carriers (-653 AG+GG, p<0,001) risulta statisticamente più elevata nei pazienti rispetto ai controlli. Relativamente ai polimorfismi -651 G>A e -617 C>A sia le frequenze alleliche che quelle genotipiche non differiscono significativamente fra pazienti MP e controlli. È stata inoltre osservata un'associazione positiva tra la variante -653G e l'età di esordio nei pazienti con MP (p<0,001). Per valutare se il -653 A> G influenza l'espressione del gene NFE2L2 abbiamo valutato i livelli di mRNA in 15 pazienti con MP idiopatica. I risultati mostrano una differenza significativa tra i G carriers e G non carriers, (AA vs AG e AA vs GG) (p<0,01). Dall’analisi dei dati relativi allo stress ossidativo, non emergono differenze significative tra i livelli plasmatici degli AOPP nei pazienti con MP rispetto ai controlli mentre per quanto riguarda la componente antiossidante, i livelli di FRAP sono risultati ridotti in pazienti MP (p<0,001) rispetto al gruppo di controllo, così come i livelli dei tioli plasmatici (-SH) (p<0,01). Suddividendo i soggetti della nostra popolazione di studio nei portatori dei tre genotipi generati dal polimorfismo -653A>G i nostri risultati mostrano un aumento significativo dei livelli plasmatici degli AOPP nei portatori del genotipo -653AG rispetto ai soggetti -653AA nel gruppo dei pazienti, mentre non si riscontrano differenze in quello dei controlli. Al contrario, i livelli plasmatici dei gruppi tiolici e FRAP totali risultano ridotti nei soggetti -653AG rispetto a quelli -653AA, nei pazienti, mentre non si riscontrano nei controlli. Non sono emerse differenze significative tra i livelli dei biomarcatori misurati nei portatori dei genotipi derivanti dagli SNPs -651G>A e -617C>A. La presenza dell'allele G sia in omozigosi che in eterozigosi determina simultaneamente l'alterazione dell'espressione del gene NFE2L2 e dei marcatori di stress ossidativo nella popolazione di studio. In particolare, i nostri risultati mostrano che nei pazienti portatori di uno o due alleli rari, è presente un deficit significativo dell'espressione del gene NFE2L2 accompagnato ad una riduzione delle difese antiossidanti (FRAP e SH) e ad un aumento delle AOPP. I dati ottenuti suggeriscono un forte coinvolgimento dello stress ossidativo e un deficit del sistema Nfe2l2-ARE nella patogenesi della MP; è possibile ipotizzare che la variante -653G sia in grado di attenuare il sistema di difesa direttamente controllato da Nfe2l2, rendendo i portatori G più suscettibili all'insulto ossidativo. Inoltre, i dati suggeriscono che la variante -653G nel gene promotore Nfe2l2 potrebbe essere un fattore di rischio comune per la MP. In linea con altri studi presenti in letteratura (Dumont et al., 2009; Gao et al., 2015; Liu et al., 2014; Tanaka et al., 2014), i risultati di questo lavoro di tesi indicano il patway Nfe2l2-ARE come un importante mediatore della neuroprotezione e suggeriscono tale sistema come possibile bersaglio terapeutico per le malattie neurodegenerative.