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L’ingegneria tissutale è una nuova disciplina biotecnologica che applica i principi ed i metodi dell’ingegneria e delle scienze della vita per comprendere a fondo la relazione che esiste tra struttura e funzione nei tessuti viventi normali e patologici, con lo scopo ultimo di produrre sostituti biologici che possano ripristinare, mantenere e migliorare le funzioni di tessuti e/o organi danneggiati. La strategia innovativa alla base dell’ingegneria tissutale consiste nell’impiego di cellule viventi (e/o loro prodotti) in combinazione con strutture tridimensionali (scaffolds) biocompatibili e biodegradabili (comunemente a matrice polimerica), per sviluppare sostituti tissutali bioattivi in grado di promuovere la rigenerazione in situ di tessuti.
Il presente studio di tesi è basato sulla produzione e caratterizzazione di tipo chimico, fisico e biologico di scaffolds polimerici a base di materiali polimerici, pensati non solo come supporto alla neo – formazione di tessuto in situ, ma anche come veicolo di uno stimolo biomolecolare che ne induca la rigenerazione.
In questo studio sono stati presi in considerazione due tipi di matrici polimeriche entrambe appartenenti alla classe dei poliesteri. Il poli(ε-caprolattone) lineare (PCL CAPA 6800 Mw = 80 000 g mol-1), è un poliestere semicristallino sintetico largamente impiegato nelle applicazioni biomediche. Nel presente lavoro di tesi il PLC è stato impiegato per la preparazione di scaffolds in combinazione con Idrossiapatite (HA), che è il principale costituente minerale del tessuto osseo ed è in grado di stimolare l’osteogenesi.
Gli scaffolds a base di PCL/HA sono stati ottenuti mediante una tecnica di prototipizzazione rapida nota come filatura ad umido (wet spinning). Questa metodologia è tra le più usate per la produzione di supporti polimerici fibrosi tridimensionali. Il polimero é dissolto in un solvente opportuno e la soluzione ottenuta viene estrusa attraverso un ago in un bagno di coagulazione formato da un non-solvente per il polimero impiegato, dove il materiale precipita sottoforma di microfibre. Il processo che si verifica nel bagno di coagulazione è noto come inversione di fase e implica la diffusione verso l’esterno del solvente e verso l’interno del non solvente con la formazione di un sistema polimero/solvente/non solvente. Il risultato che si ottiene è una struttura polimerica tridimensionale altamente porosa.
Le dimensioni delle microfibre e la porosità di superficie degli scaffolds preparati sono stati caratterizzati mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Le valutazioni biologiche di citotossicità, adesione cellulare al substrato e induzione della colonizzazione dello scaffold sono state condotte utilizzando la linea cellulare di preosteoblasti murini embrionali MC-3T3-E1, a diversi intervalli di tempo, mediante saggi colorimetrici di vitalità e proliferazione cellulare (Sale di tetrazolio WST-1), ed attraverso la tecnica di microscopia confocale a scansione (CLSM). Per la valutazione del grado di differenziamento cellulare e di mineralizzazione ossea sono stati applicati i metodi della valutazione dell’attività della fosfatasi alcalina (ALP) e il saggio del rosso alizarina (Alizarin Red). I risultati ottenuti hanno evidenziato che i preosteoblasti MC-3T3-E1 sono in grado di aderire, migrare e proliferare sugli scaffolds a base di PCL/HA e che tali scaffolds favoriscono il processo di differenziamento e mineralizzazione ossea.
Parallelamente è stato iniziato uno studio volto a valutare la biocompatibilita’ di un poliestere di origine batterica, il poli(3-idrossibutirrato-co-3-idrossiesanoato) [PHBHHx]. Prima del suo utilizzo nelle prove biologiche il copolimero PHBHHx e’ stato purificato tramite filtrazione e precipitazione in acqua e quindi è stato utilizzato per produrre films polimerici mediante la tecnica di evaporazione del solvente (film casting). I campioni preparati sono stati sottoposti a valutazione della citotossicita’ in vitro utilizzando la linea cellulare di fibroblasti murini embrionali balb/3T3 CloneA31. I risultati ottenuti dalle indagini sia di tipo quantitativo (Sale di tetrazolio WST-1) che qualitativo (colorazione con Blu di toluidina e microscopia confocale a scansione) hanno evidenziato la citocompatibilita’ del poliestere PHBHHx e la sua capacita’ di sostenere una buona adesione e proliferazione cellulare. Successivamente, sempre tramite wet-spinning, sono stati preparati scaffolds tridimensionali utilizzando sia PHBHHx da solo che in combinazione con il PCL. Attualmente sono in corso le valutazioni biologiche volte a valutare la capacita’ dei sistemi microstrutturati a base di PHBHHx di sostenere una buona adesione e proliferazione cellulare della linea di preosteoblasti murini MC-3T3-E1.