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La ricerca di nuovi farmaci immunosoppressori in grado di controllare il rigetto d'organo dopo trapianto è motivata dalla bassa specificità e dai numerosi effetti collaterali sistemici delle attuali terapie immunosoppressive. La fotochemioterapia extracorporea (ECP), o fotoferesi, rappresenta una innovativa metodica immunoterapeutica basata sull'aferesi, che consiste nell'esposizione extracorporea di leucociti mononucleati del sangue periferico alla radiazione ultravioletta A (UV A) in presenza di 8¬methoxypsoralene (8-MOP). L'8-MOP con luce UV A a lunghezze d'onda comprese tra 340-380 nrn genera una reazione fotochimica: può formare un legame covalente con una base pirimidinica (mono-addotti), ed è in grado di formare un ponte tra due basi pirimidiniche situate ciascuna su un filamento di DNA (legame crociato). L'effetto biologico a livello cellulare si traduce nella inibizione della sintesi del DNA. La fotoferesi è stata utilizzata con successo nel trattamento dellinfoma cutaneo a cellule T, sperimentata in malattie a patogenesi autoimmune quali, ad, esempio, l'artrite reumatoide e illupus eritematoso sistemico; recentemente è oggetto di studio l'impiego terapeutico nel trattamento del rigetto d'organo acuto e cronico in seguito ad allotrapianto. L'immunosoppressione è attualmente uno dei principali approcci per la prevenzione ed il trattamento del rigetto del trapianto. Dopo trapianto di un organo solido, le alloreazioni sviluppate dal sistema immunitario del ricevente sono dirette contro le cellule dell'organo trapiantato; nella reazione di rigetto sono coinvolte cellule presentanti l'antigene capaci di stimolare i linfociti T, tra cui un ruolo importante è svolto dalle cellule dendritiche (DC). Data l'influenza che queste cellule esercitano sull'andamento del trapianto, gli studi attuali sono volti a cercare nuovi approcci terapeutici per influenzare le DC stesse: la fotoferesi e uno di questi.
Presso l'Unità Trasfusionale dell' ospedale Cisanello di Pisa si esegue la pratica clinica della fotoferesi in pazienti sottoposti a trapianto d'organo solido associata a terapia con farmaci immunosoppressori.
L'obiettivo di questo studio è l'investigazione in vitro degli effetti immunomodulatori della fotoferesi sulla generazione e maturazione delle cellule dendritiche, in associazione con alcuni dei farmaci immunosoppressori utilizzati in terapia clinica (FK-506/Tacrolimus, Micofenolato-mofetile, Methil-prednisolone/Urbasol).
MATERIALI E METODI: Le cellule dendritiche sono generate da monociti (CD14+) ottenuti da cellule mononucleate di buffy-coats di donatori sani mediante separazione su gradiente di densità e separazione immunomagnetica (MACS, Miltenyi Biotec). Le cellule CDI4+ sono coltivate in presenza di citochine(50 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml IL-4) in RPMI-1640 addizionato di siero fetale bovino al 10%, glutammina (2 mM) e antibiotici (streptomicina 100Jlg/ml, pennicillina 100 IU/ml). In queste condizioni di coltura (a 37°C e 5% CO2), i monociti si differenziano dopo 6 giorni in una popolazione omogenea di DC ad uno stadio immaturo. La maturazione è indotta mediante aggiunta di LPS (10 ng/ml) alla coltura per 24 ore. Per valutare l'effetto dell'interazione dei farmaci immunosoppressori sulla generazione delle DC, i monociti sono incubati con 2 concentrazioni diverse di Methil-prednisolone (10-7 M e 10-8 M) di FK-506 (10 ng/ml o 1 ng/ml) e di Micofenolato-mofetile (10-7 M e 10-8 M). I farmaci immunosoppressori sono aggiunti in coltura ai giorni +1 o +3. In parallelo sono studiati gli effetti dell' 8-MOP e luce UVA da soli o in associazione con i 3 farmaci; per questo scopo, al giorno 0 i monociti in terreno completo sono incubati con 8-MOP (100 ng/ml) per 20 minuti a 37°C e successivamente irradiati (2 J/cm2) mediante l'utilizzo di uno strumento tarato per l'emissione di luce UV A (UVA light box, Therakos).
Ai giorni +6 e +7, è effettuata, con metodo citofluorimetrico, una caratterizzazione fenotipica (espressione delle molecole CDla, CD14, CD40, CD80, CD83 e HLA-DR) e funzionale delle cellule ottenute. Le proprietà funzionali delle DC sono esplorate mediante la valutazione della fagocitosi (pinocitosi di FITC-destrano), e della capacità di presentare l'antigene e stimolare i linfociti T (reazione linfocitaria mista). Studi aggiuntivi sono condotti allo scopo di investigare la capacità delle cellule mononucleate di pazienti sottoposti a trapianto epatico in trattamento con i farmaci immunosoppressori sopra descritti e fotoferesi di generare DC in vitro.