• valutare l'attività mutagena della Bleomicina
• saggi biologici
• Ottimizzazione

La bleomicina è un antibiotico ad azione antitumorale, prodotto dal batterio Streptomyces verticillus. Questo farmaco è utilizzato in ambito chemioterapico per il trattamento di Linfoma di Hodgink e non-Hodgink, cancro dei testicoli, cancro della testa e del collo, cancro alla cervice uterina, cancro ai genitali esterni e carcinomi a cellule squamose.
La BLM è in grado di intercalarsi random nel doppio filamento di DNA e formare radicali liberi citotossici che causano Double Strand Break (DSB) in situ. A seguito della formazione di DSB, viene innescata una complessa cascata di eventi finalizzati al blocco del ciclo cellulare e al reclutamento di fattori di riparazione. Uno degli iniziatori del processo è la proteina chinasi ATM (Ataxia Talangiectasia Mutated) che causa, in concerto con la chinasi ATR (Ataxia Talangectasia Related) e la DNA-PKcs (DNA Dependent Protein Kinase catalytic subunit), la fosforilazione delle proteine istoniche attorno alla lesione, fra le quali, l’istone ɤH2AX. Questo viene fosforilato a livello della serina-139 in una regione, che si estende per circa 2Mb di DNA nei pressi del DSB. La lesione può essere successivamente riparata attraverso la ricombinazione non omologa (NHEJ) o la ricombinazione omologa (HR).
Nel presente progetto di tesi è stata considerata la proprietà genotossica del farmaco, in particolare, preliminarmente all’utilizzo di BLM-coniugata con un oligonucleotide per verificare se riesca ad indurre un arricchimento di lesioni sito-specifiche nel genoma mimando un Gene-editing locus specifico (simile al ruolo della sg-RNA nel CRISPR-Cas9). Oligonucleotidi a singolo filamento (20bp) sono stati disegnati complementari a sequenze dell’esone 3 del gene ipoxantina fosforibosiltransferasi (HPRT, q26.2-26.3 chrX).
L’HPRT assay, un test di mutagenesi in vitro su cellule di mammifero è stato utilizzato per saggiare l’azione mutagena della BLM. L’impiego di una linea cellulare emizigote per il cromosoma X (HCT116 tumorali di cancro al colon retto) assicura al test il vantaggio di poter evidenziare fenotipicamente le mutazioni avvenute sul DNA in seguito al trattamento. Il farmaco, somministrato alle dosi 1µM – 1.4 µM - 2µM per 24h, ha indotto nella linea cellulare un aumento del numero di colonie di 2.14 volte per unità di dose, risultato statisticamente significativo.
La “Chromatin immunoprecipitation” (ChIP) con un anticorpo Anti-fosfoɤH2AX è stata effettuata su cellule trattate con BLM non coniugata, e il relativo controllo negativo. La successiva analisi basata su qPCR con sistema EXPRESS SYBR® GreenER ™ usando come gene target HPRT e come geni di controllo GYG2, GSS, OGT, Erα, precedentemente testati, ci consentirà di verificare i DSBs indotti a seguito del trattamento.
Il Surveyor Nuclease Assay” è stato utilizzato per individuare le lesioni al DNA non correttamente riparate dal sistema NHEJ che causano mutazioni in/del e polimorfismi. Questa tecnica è basata sulla capacità della surveyor nucleasi di tagliare selettivamente, in prossimità dei “mismatch”, il DNA eteroduplex formatosi per “cross-annealing” della sequenza mutata con la sequenza “wild-type”. I prodotti risultanti sono analizzati successivamente mediante elettroforesi su gel di agarosio.
La trasfezione con vettore HR410PA-1, opportunamente costruito, è stata utilizzata per quantificare l’avvenuta HR nel locus HPRT in cellule coltivate e sottoposte a varie tipologie di trattamento.
In futuro, questi saggi consentiranno di capire se il locus HPRT sarà soggetto ad attività mutagena sito-specifica indotta dalla BLM quando coniugata con specifici oligonucleotidi.