Tesi etd-06272016-143047 |
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Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
PUCCI, CECILIA
URN
etd-06272016-143047
Titolo
Effetti della berberina, un alcaloide naturale, sullo sviluppo embrionale del sistema modello zebrafish.
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Relatori
relatore Prof. Andreazzoli, Massimiliano
Parole chiave
- alcaloide naturale
- berberina
- modello zebrafish
- papaveracea Chelidonium majus
- potenziale terapeutico
- proprietà farmacologiche
- sistema cardiovascolare
- sviluppo embrionale
- uso in gravidanza
Data inizio appello
18/07/2016
Consultabilità
Completa
Riassunto
La berberina (18,5,6-diidro-9,10-dimethoxybenzo (g) -1,3-benzodioxolo (5,6-a) quinolizinium) è un alcaloide di origine naturale estratto principalmente dalla papaveracea Chelidonium majus, ampiamente utilizzato per le sue molteplici proprietà farmacologiche, sulla quale si concentrano le ricerche di numerosi studi. Il potenziale terapeutico della berberina è noto nel trattamento contro il diabete, il colesterolo, i trigliceridi elevati nel sangue e altre sindromi metaboliche. Per ottenere effetti positivi nell'uomo, la dose orale di berberina è di 300 mg, assunta tre volte al giorno. Tuttavia, la mancanza di prove scientifiche in merito agli effetti collaterali sullo sviluppo embrionale, suggerisce limitazioni nell'uso della berberina in gravidanza e durante l'allattamento.
Lo scopo del mio lavoro si basa sulla ricerca di possibili effetti della berberina sullo sviluppo embrionale del pesce teleosteo zebrafish (Danio rerio), un animale modello recentemente proposto come valido sistema per la valutazione degli effetti tossicologici e teratogeni di sostanze con potenzialità terapeutiche.
Nel presente lavoro di tesi, ci proponiamo di effettuare una valutazione tossicologica/teratogena della berberina utilizzando gli embrioni della linea “casper”, che offre notevoli vantaggi in merito alla trasparenza dei tessuti anche a stadi più avanzati, poiché non presenta iridofori e melanofori.
In linea con precedenti lavori, in una serie di esperimenti abbiamo applicato berberina sciolta in Hank’s buffer a pH 7.46 a 24hpf a concentrazioni crescenti (50, 100, 200, 400 mg/L) ed abbiamo quantificato la percentuale di mortalità ottenuta nell’ arco delle 96h di esposizione alla sostanza (120hpf), confrontandola con quella di embrioni di controllo incubati nel solo Hank’s buffer. I risultati di questi esperimenti indicano che la berberina ha effetti tossici concentrazione-dipendenti e forniscono valori di LC50 (la concentrazione alla quale si ottiene il 50% di mortalità) di circa 156 ± 4,96 mg/L a 120hpf. Abbiamo inoltre osservato che il trattamento con berberina induce una serie di gravi alterazioni tra cui, molto significativi, risultano gli edemi pericardici. In aggiunta, abbiamo trattato gli embrioni con concentrazioni sub-letali di berberina, applicando la sostanza a diversi stadi di sviluppo (24 hpf, 48 hpf, 72 hpf, 96 hpf) e lasciandola agire per diversi tempi di esposizione (fino a 120hpf). In alcuni casi, gli esperimenti hanno inoltre previsto lavaggi successivi all'incubazione con berberina. I risultati ottenuti indicano che: I) la berberina è in grado di promuovere un significativo incremento degli embrioni con edemi pericardici quando viene applicata molto precocemente (tra 24 hpf e 48 hpf); II) la massima capacità di indurre edemi con dosi sub-letali (pari a 100mg/L) si ottiene quando la sostanza è applicata a 24hpf per una durata di esposizione di circa 48h-72h; III) la berberina è in grado di indirizzare, almeno in parte, le alterazioni fenotipiche anche dopo che viene rimossa dal mezzo.
Essendo noto che edemi pericardici possono essere dovuti ad alterazioni della normale morfogenesi precoce del cuore e/o ad alterazioni della vascolarizzazione, per indagare i meccanismi alla base dell'azione della berberina, abbiamo eseguito ibridazione in situ whole-mount utilizzando sonde antisenso dirette contro cmlc2, un marker ventricolo-atriale che consente di osservare il looping cardiaco, bmp4 e notch1b, marcatori valvolari rispettivamente a livello dei tessuti miocardico ed endocardico. I dati preliminari indicano che la berberina, a dosi sub-letali, è in grado di indurre un mancato/ritardato looping cardiaco, mentre sono ancora in corso gli studi su bmp4 e notch1b. Per investigare potenziali effetti sulla vascolarizzazione, stiamo procedendo con il metodo della colorazione dei vasi mediante fosfatasi alcalina. A ulteriore completamento di questi dati, sono previste inoltre analisi istologiche, al fine di valutare la morfologia cellulare e delle strutture cardiache/valvolari.
Lo scopo del mio lavoro si basa sulla ricerca di possibili effetti della berberina sullo sviluppo embrionale del pesce teleosteo zebrafish (Danio rerio), un animale modello recentemente proposto come valido sistema per la valutazione degli effetti tossicologici e teratogeni di sostanze con potenzialità terapeutiche.
Nel presente lavoro di tesi, ci proponiamo di effettuare una valutazione tossicologica/teratogena della berberina utilizzando gli embrioni della linea “casper”, che offre notevoli vantaggi in merito alla trasparenza dei tessuti anche a stadi più avanzati, poiché non presenta iridofori e melanofori.
In linea con precedenti lavori, in una serie di esperimenti abbiamo applicato berberina sciolta in Hank’s buffer a pH 7.46 a 24hpf a concentrazioni crescenti (50, 100, 200, 400 mg/L) ed abbiamo quantificato la percentuale di mortalità ottenuta nell’ arco delle 96h di esposizione alla sostanza (120hpf), confrontandola con quella di embrioni di controllo incubati nel solo Hank’s buffer. I risultati di questi esperimenti indicano che la berberina ha effetti tossici concentrazione-dipendenti e forniscono valori di LC50 (la concentrazione alla quale si ottiene il 50% di mortalità) di circa 156 ± 4,96 mg/L a 120hpf. Abbiamo inoltre osservato che il trattamento con berberina induce una serie di gravi alterazioni tra cui, molto significativi, risultano gli edemi pericardici. In aggiunta, abbiamo trattato gli embrioni con concentrazioni sub-letali di berberina, applicando la sostanza a diversi stadi di sviluppo (24 hpf, 48 hpf, 72 hpf, 96 hpf) e lasciandola agire per diversi tempi di esposizione (fino a 120hpf). In alcuni casi, gli esperimenti hanno inoltre previsto lavaggi successivi all'incubazione con berberina. I risultati ottenuti indicano che: I) la berberina è in grado di promuovere un significativo incremento degli embrioni con edemi pericardici quando viene applicata molto precocemente (tra 24 hpf e 48 hpf); II) la massima capacità di indurre edemi con dosi sub-letali (pari a 100mg/L) si ottiene quando la sostanza è applicata a 24hpf per una durata di esposizione di circa 48h-72h; III) la berberina è in grado di indirizzare, almeno in parte, le alterazioni fenotipiche anche dopo che viene rimossa dal mezzo.
Essendo noto che edemi pericardici possono essere dovuti ad alterazioni della normale morfogenesi precoce del cuore e/o ad alterazioni della vascolarizzazione, per indagare i meccanismi alla base dell'azione della berberina, abbiamo eseguito ibridazione in situ whole-mount utilizzando sonde antisenso dirette contro cmlc2, un marker ventricolo-atriale che consente di osservare il looping cardiaco, bmp4 e notch1b, marcatori valvolari rispettivamente a livello dei tessuti miocardico ed endocardico. I dati preliminari indicano che la berberina, a dosi sub-letali, è in grado di indurre un mancato/ritardato looping cardiaco, mentre sono ancora in corso gli studi su bmp4 e notch1b. Per investigare potenziali effetti sulla vascolarizzazione, stiamo procedendo con il metodo della colorazione dei vasi mediante fosfatasi alcalina. A ulteriore completamento di questi dati, sono previste inoltre analisi istologiche, al fine di valutare la morfologia cellulare e delle strutture cardiache/valvolari.
File
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1_INDICE.pdf | 895.14 Kb |
2_RIASSUNTO.pdf | 313.53 Kb |
3_INTRODUZIONE.pdf | 1.44 Mb |
4_SCOPO_..._TESI.pdf | 444.57 Kb |
5_MATERI...ETODI.pdf | 743.58 Kb |
6_RISULTATI.pdf | 1.93 Mb |
7_DISCUS...SIONI.pdf | 351.26 Kb |
8_BIBLIOGRAFIA.pdf | 594.60 Kb |
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