• epigenetica
• istone demetilasi JmjD3
• retinogenesi
• sviluppo dell'occhio
• Xenopus laevis

Le modificazioni istoniche regolano la trascrizione genica influendo sulla compattazione della cromatina, sull'accessibilità del DNA, e sul reclutamento del macchinario e dei regolatori trascrizionali. Esse rientrano nel più ampio spettro dei cambiamenti che influenzano il fenotipo, senza alterare il genotipo, e che vanno sotto il nome di epigenetica.
Gli istoni possono andare incontro a diversi tipi di modificazioni post-traduzionali; una di queste è la metilazione, la quale viene mediata da una classe di enzimi, le istone metil-transferasi, che determinano il trasferimento di un gruppo metilico ad una lisina o ad un'arginina presente all'estremità N-terminale degli istoni H3 o H4. Particolare rilevanza assume la metilazione delle lisine dell'istone H3, che può tradursi in un'attivazione o una repressione trascrizionale a seconda delle specifiche lisine metilate.
Nel laboratorio dove ho svolto il mio progetto di tesi si studia da diversi anni il ruolo svolto dalla proteina Jhdm1D durante la retinogenesi dei girini dell'anfibio anuro Xenopus laevis. Si tratta di una istone demetilasi, appartenente alla famiglia Jumonji, in grado di rimuovere i gruppi metile dalle lisine 9 e 27 mono- e di-metilate, riconosciute come marcatore di repressione della trascrizione genica. I lavori effettuati finora dal nostro gruppo hanno indicato che il guadagno di funzione porta ad un aumento del numero di fotorecettori, associato ad una riduzione delle cellule bipolari. È inoltre stato precedentemente osservato che la sovraespressione di Jhdm1D porta ad un significativo aumento della percentuale di bastoncelli rispetto ai coni negli esperimenti di sovraespressione. Questi dati hanno quindi suggerito un importante ruolo della Jhdm1D nel differenziamento neuronale retinico. Per analizzare ulteriormente il ruolo retinico di Jhdm1D con un approccio complementare, erano stati infine condotti degli esperimenti preliminari riguardanti la perdita di funzione del gene.
In questo lavoro di tesi è stato innanzitutto approfondito lo studio sulla perdita di funzione del gene jhdm1d, ottenuto attraverso l'iniezione di un oligonucleotide antisenso morfolino (MoJhdm1D), insieme al messaggero della Green Fluorescent Protein (GFP), nel blastomero D1.2 allo stadio di 16 cellule. La scelta di questo blastomero risiede nel fatto che il D1.2 è, tra i blastomeri animali, quello la cui progenie contribuisce in misura minore alla popolazione cellulare della retina. Questa peculiarità del blastomero D1.2 permette, mediante tecniche di microscopia, di distinguere e quantificare, nella retina matura, i cloni retinici nei quali è stato inattivato jhdm1d, resi riconoscibili dalla presenza di GFP. Più in dettaglio, gli embrioni sono stati fissati mediante paraformaldeide al termine della retinogenesi (stadio 42), crioprotetti, inclusi e sezionati al criostato. In questo modo è stato possibile ottenere sezioni di retina, trattate poi con Hoechst in modo da eseguire la conta dei diversi tipi cellulari (fotorecettori, orizzontali, bipolari, amacrine, gangliari) GFP-positivi in ciascuno strato della retina completamente differenziata. Questa analisi ha mostrato che la perdita di funzione del gene jhdm1d, rispetto ai controlli iniettati con un morfolino di controllo standard (MoSTD), porta ad una diminuzione dei fotorecettori e ad un incremento delle cellule bipolari.
Inoltre, in questi cloni retinici è stata anche condotta una preliminare quantificazione della presenza di bastoncelli mediante immunostaining con anticorpo anti-rodopsina. Da questa prima analisi sembra che la perdita di funzione non alteri le proporzioni di coni e bastoncelli nelle retine mature.
Un altro aspetto preso in analisi nel mio progetto di tesi è l'eventuale interazione tra la Jhdm1D e la proteina JmjD3, un'altra istone demetilasi della famiglia Jumonji che è espressa, e sembra avere un ruolo, nella retina. Questa proteina, a differenza della Jhdm1D, rimuove la di- e tri-metilazione della lisina 27 dell'istone H3. Come risultato dell'azione di JmjD3 si ottiene la generazione di lisine 27 mono- e di-metilate sull'istone H3, che risultano essere a loro volta substrato per la Jhdm1D.
Da studi preliminari condotti nel nostro laboratorio in precedenza a questo lavoro di tesi, sembra che la sovraespressione di JmjD3 determini una diminuzione delle cellule amacrine rispetto ai controlli, svolgendo quindi, durante la retinogenesi, un ruolo diverso rispetto a quello svolto da Jhdm1D. Abbiamo perciò ritenuto interessante indagare su quale possa essere l'effetto della contemporanea sovraespressione di entrambe le metilasi. Sono quindi state effettuate delle iniezioni di mRNA codificanti per Jhdm1D, JmjD3 e GFP nel blastomero D1.2, ottenendo retine su cui è stata effettuata la quantificazione dei diversi tipi cellulari. L'analisi di queste retine ha dato come risultato un significativo aumento dei fotorecettori e delle cellule gangliari, e una significativa diminuzione delle cellule bipolari, rispetto ai controlli iniettati con il solo messaggero per la GFP.
L'azione combinata delle due proteine porterebbe quindi alla comparsa di un nuovo effetto, non presente nel caso di acquisto di funzione per la sola Jhdm1D, e cioè un aumento delle cellule gangliari.