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Titolo: Valutazioni farmacocinetiche e farmacodinamiche di una nuova formulazione per uso oftalmico.
Introduzione: Dietro alla nascita di un nuovo farmaco vi è una complessa attività di ricerca e sviluppo, spesso onerosa in termini economici, dettata dai tempi lunghi e dall’incertezza. In particolare, la ricerca oftalmologica ha investito molto su un particolare principio attivo con proprietà antiallergiche, il Ketotifene fumarato. Esso viene utilizzato per la cura delle congiuntiviti allergiche in quanto interagisce, bloccandoli, con i recettori H1 dell’istamina, che mediano le risposte infiammatorie. Le specialità attualmente in commercio si presentano a due concentrazioni: 0.025% e 0.05% di Ketotifene fumarato. La posologia di un collirio a base di Ketotifene è di 1/2 gocce 2-4 volte al dì a seconda della concentrazione del principio attivo.
Scopo della ricerca: La collaborazione tra Farmigea Spa ed il Dipartimento di Neuroscienze di Pisa nasce allo scopo di trovare una formulazione oftalmica “once a day” a base di Ketotifene fumarato e TS-Polisaccaride, un polimero naturale ottenuto per estrazione dai semi di Tamarindo, per consentire una riduzione delle somministrazioni giornaliere a vantaggio della compliance del paziente.
Materiale e Metodi: Per lo studio sperimentale formulativo, condotto nel laboratorio di Ricerca e Sviluppo di Farmigea, sono state preparate sei formulazioni: quattro a base di Ketotifene fumarato e TSP, due a base di solo Ketotifene fumarato, utilizzate come controllo. Tali preparazioni sono state analizzate e sottoposte a protocolli di stabilità preliminare con cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) mediante studio long term (25 °C) e studio accelerated (40 °C) a 1, 2, 3 e 6 mesi. Per lo studio sperimentale pre-clinico sono stati utilizzati maschi adulti di Guinea Pigs Dunkin Hartley con un peso di circa 250±50 g. Nella prima fase della sperimentazione sono stati suddivisi in 6 gruppi sperimentali di 6 animali ciascuno: 1) Ketotifene 0.05% in soluzione fisiologica (controllo); 2) Ketotifene 0.025% in soluzione fisiologica (controllo); 3) Ketotifene 0.05% in TSP 0.2 % ; 4) Ketotifene 0.025% in TSP 0.2% ; 5) Ketotifene 0.05% in TSP 0.5% ; 6) Ketotifene 0.025% in TSP 0.5% per la valutazione a 20h e 24h, nella seconda fase di sperimentazione pre-clinica sono stati utilizzati 3 gruppi sperimentali di 6 animali ciascuno, usando 3 formulazioni con Ketotifene: 1) Ketotifene 0.05% in soluzione fisiologica (controllo); 2) Ketotifene 0.05% in TSP 0.2%; 3) Ketotifene 0.05% in TSP 0.5% per la valutazione a 72h, 90h e 100h.
Per entrambe le fasi si è proceduto come segue: gli occhi destri sono stati trattati con 20 µl di formulazione in esame dopo 20h e 24h nella prima fase sperimentale e dopo 72h, 90h e 100h nella seconda fase sperimentale con Istamina (300 nmoli in 10 µl di NaCl 0.9%), principale mediatore della risposta allergica. Per la valutazione dell’arrossamento/edema congiuntivale gli animali sono stati anestetizzati con cloralio idrato 9% (400 µl/100 g di peso corporeo) ed è stata somministrata i.v. nella giugulare destra dell’animale una soluzione contenente Evans Blue come colorante (25 mg/kg di peso corporeo sciolti in 1 ml di NaCl 0.9%) 1 h prima del trattamento con Istamina; 30 minuti dopo la somministrazione di istamina gli animali sono stati soppressi. Le palpebre ed i globi oculari sono stati rimossi, pesati e trasferiti in un tubo di vetro contenente una soluzione 30:70 di Sodio Solfato (0.3%): acetone e mantenuti in agitazione per 24h. I tubi sono stati successivamente vortexati e centrifugati (1000 rpm per 10 min). Infine il surnatante è stato trasferito in una multiwell da 96 pozzetti e l’assorbanza letta a 620 nm (Multiskan FC, Thermo Labsystenm). Per la determinazione del contenuto di Evans Blue è stata fatta una retta di taratura contenente concentrazioni scalari del colorante sciolto nella soluzione di estrazione. I dati ottenuti dagli studi pre-clinici sono stati valutati con il test di Student e le differenze considerate significative per p<0.05.
Risultati: Per lo studio sperimentale formulativo i dati di stabilità per il Ketotifene fumarato ed il TSP, ottenuti con cromatografia liquida ad alta pressione, rientrano nelle specifiche del metodo di analisi approvato da Farmigea (95,0 ÷ 105,0% per il Ketotifene fumarato; 90,0 ÷ 105,0% per il TSP). Nella prima fase di sperimentazione pre-clinica, per tutte e sei le formulazioni è possibile osservare come dopo 20h e 24h dal trattamento, il contenuto di Evans Blue rilevato nell’occhio trattato (destro) sia significativamente inferiore rispetto alle quantità del colorante rilevate nell’occhio non trattato (sinistro). Inoltre, i dati ottenuti nell’animale per le sei formulazioni alle 20h ed alle 24h non evidenziano valori significativamente differenti tra di loro. Ciò ha condotto ad una seconda fase sperimentale con 3 formulazioni di Ketotifene 0.05% a concentrazioni diverse di TSP; i risultati ottenuti alle 72h mostrano un’efficacia terapeutica delle soluzioni utilizzate ed anche in questo caso senza differenze significative tra di loro. Dopo 90h dal trattamento si evidenzia l’assenza di una protezione anti-istaminica da parte del Ketotifene 0.05% e Ketotifene 0.05% in TSP 0.5%, tuttavia la formulazione contenente Ketotifene 0.05% in TSP 0.2% risulta ridurre significativamente la reazione iperemica indotta dall’Istamina (p<0.05) e presenta un interessante trend riduttivo anche nei confronti della formulazione con TSP 0.5% (p=0.06).
Conclusioni: Lo studio sperimentale formulativo ha confermato la stabilità delle soluzioni alle diverse condizioni testate nell’arco di 1, 2, 3 e 6 mesi. Dallo studio sperimentale pre-clinico è possibile osservare come la formulazione a base di Ketotifene 0.05% in TSP 0.2% mostri una maggiore durata dell’efficacia terapeutica sulla superficie oculare dell’animale. Questo risultato lascia intravedere la possibilità di uno sviluppo industriale da parte dell’azienda Farmigea.