• citotossicità
• genotossicità
• macrofagi alveolari murini
• nanoparticelle d'oro

La rapida espansione delle nanotecnologie sta producendo un ampio assortimento di materiali nanostrutturati ingegnerizzati (ENM) che si diversificano nella loro composizione chimica, dimensione, forma, carica e chimica di superficie, così come nel rivestimento e nel loro stato di dispersione. Tali materiali nanostutturati stanno entrando rapidamente nei cicli produttivi di una vasta gamma di prodotti, tra cui farmaci, cosmetici e prodotti biomedicali, generando un aumento delle domande sui possibili rischi per la salute umana e ambientale.
Negli studi tossicologici volti a rispondere a queste domande, tuttavia, i nanomateriali presentano le loro peculiari proprietà chimico-fisiche che possono ostacolare lo sviluppo di protocolli affidabili e comparabili per la valutazione della corretta nanotossicità. È ormai ampiamente riconosciuto che una caratterizzazione dettagliata dei nanomateriali sia cruciale per evitare la presenza di risultati dissimili nella valutazione del loro potenziale tossico, anche dovuto alla loro instabilità colloidale, propensione all’aggregazione, e alla dispersione in soluzione. Similmente, è anche di grande importanza la scelta del dosaggio, nonostante i risultati contrastanti segnalati fino ad ora.
Inoltre, diversi studi hanno dimostrato come possano generarsi interazioni bio-fisico-chimiche nell’interfaccia bio-nano, come per esempio la formazione di proteine corona (rivestimento proteico sulla superficie disponibile degli ENM), che possono giocare un ruolo significativo nell’uptake dei nanomateriali, con possibili influenze sulle risposte cito e genotossiche dei sistemi biologici. Tutte queste problematiche rendono difficile il confronto dei risultati sperimentali ottenuti nei differenti studi nanotossicologici. In questo contesto, è importante definire una strategia rigorosa per studiare le complesse interazioni che avvengono tra gli ENM e i sistemi biologici, tramite una profonda caratterizzazione dei primi, seguita da una ben consolidata procedura sperimentale in vivo. Lo studio sull’oro nanoscala è di grande interesse e largamente applicato in ambiti bio-medici, tra cui la somministrazione di farmaci, la terapia fototermica, l’utilizzo come sonda e nell’imaging cellulare. Tuttavia un gran numero di studi recenti evidenziano un comportamento tossico delle nanoparticelle di oro (AuNP). Lo scopo di questa tesi è quindi valutare le risposte citotossiche e genotossiche indotte da nanoparicelle di oro, di diverse dimensioni, in sistemi in vitro al fine di valutare l’importanza della dimensione nella bioreattività di questi emergenti nanomateriali.
Le AuNP utilizzate per questo studio hanno un diametro nominale di 5, 15 e 40 nm e i dati sperimentali sono stati raccolti dopo l’esposizione di macrofagi alveolari murini, RAW264.7, in rappresentazione di uno degli organi bersaglio, l’apparato respiratorio.
Il potenziale citossico è stato valutato per tempi di esposizione e concentrazioni di massa differenti con un saggio spettrofotometrico, il test MTT, e con la colorazione al Trypan blue, un saggio colorimetrico.
Il potenziale genotossico delle nanoparticelle oggetto di studio è stato valutato mediante l’evoluzione del test del micronucleo inizialmente messo a punto per la determinazione di effetti clastogeni e aneuploidogeni, oggi esteso alla valutazione di una serie di parametri citogenetici e cellulari, quali la presenza di ponti nucleoplasmatici e buds (gemmazioni nucleari), così come la valutazione degli indici apoptotici, necrotici e mitotici secondo un nuovo protocollo di analisi denominato CBMN Cytome assay .
Una successiva analisi delle lesioni al DNA è stata condotta mediante elettroforesi di lisati cellulari sospesi in agarosio (test della cometa). In questo lavoro di tesi, il test della cometa è stato eseguito con e senza l’uso degli enzimi di restrizione ENDOΙΙΙ e FPG per evidenziare oltre al danno primario al DNA (lesioni a singolo e doppio filamento) anche il danno di tipo ossidativo indotto differenzialmente nelle basi puriniche e pirimidiniche. Le nanoparticelle utilizzate hanno indotto sia risposte citotossiche che genotossiche in maniera differenziale rispetto alle loro dimensioni, ai tempi dei trattamenti e alle concentrazioni di massa utilizzate. Valutazioni del contributo dell’area superficiale, del numero di nanoparticelle e della concentrazione molare si sono rese necesarie per una migliore e più completa analisi dei risultati ottenuti.