• antiangiogenici
• antitumorali
• inibitori multitarget
• inibitori tirosin chinasici
• pirazolo-pirimidine

Le tirosin chinasi sono enzimi che regolano numerosi processi cellulari, quali la proliferazione e la differenziazione cellulare, e possono essere coinvolti nel processo di oncogenesi poiché catalizzano la fosforilazione dei residui di tirosina di alcuni recettori cellulari, tra cui EGFR, VEGFR-1 e -2 e RET. Il fattore di crescita endoteliale (VEGFs) e la rispettiva famiglia di recettori tirosin chinasici (VEGFRs) sono le proteine chiave che modulano l’angiogenesi normale e patologica. EGFR è necessario per una normale proliferazione, sopravvivenza, adesione, migrazione e differenzazione cellulare ma una non corretta regolazione di questa via può portare all’oncogenesi. L’oncogene RET è stato descritto essere implicato nello sviluppo del cancro alla midollare della tiroide (MTC). L’attivazione della linea germinale di RET e le mutazioni somatiche sono state identificate come la prima causa di MTC ereditario e sporadico (Ball 2007). Le molecole inibitrici le tirosin-chinasi (TKI) risultano, quindi, avere un ruolo promettente nel trattamento dell’oncogenesi e dell’angiogenesi patologica, in quanto determinano l’inibizione della trasmissione del segnale mitogeno attraverso VEGFR e EGFR, impedendo la fosforilazione dei residui di tirosina associati al recettore. Pertanto l’interesse dell’ odierna ricerca si è rivolto alla sintesi di nuove piccole molecole inibenti le TK associate ai diversi recettori dei fattori di crescita. Nei laboratori del Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università di Pisa sono stati recentemente sintetizzati nuovi composti. Tra questi vi sono i derivati a nucleo pirazolo[3,4-d] pirimidinico, con sostituenti sulle posizioni 2 e 4 dell’eterociclo, e derivati saccarinici.
Tra i vari composti sintetizzati ed inizialmente screenati (CLM3, CLM13, CLM24, CLM29, CLM30, CLM32, CLM34, CLM46, CLM94 e CLM100) sono stati scelti il composto CLM3 e CLM29 tra le pirazolo-pirimidine, CLM94 e CLM100 tra i derivati saccarinici. Lo scopo di questa tesi è stato di dimostrare innanzitutto l’effetto antiproliferativo e pro-apoptotico di questi quattro composti in linee cellulari endoteliali microvascolari (HMVEC-d). L’attività di CLM3 è stata valutata oltre che sulla linea endoteliale, anche su una linea tumorale di carcinoma polmonare (A549) e due linee tumorali tiroidee (8305C e TT). Per quanto riguarda i saggi di citotossicità le cellule sono state trattate con CLM3 (0,001-100µM), CLM100 (0,01-10µM) e con il solo veicolo per 24h e 72h. Alla fine del trattamento le cellule staccate con tripsina/EDTA sono state contate e il numero di cellule sopravvissute al trattamento è stato espresso come percentuale rispetto alle cellule di controllo. La valutazione dell’apoptosi indotta dal trattamento con CLM3 alle concentrazioni di 100nM, 0,4nM e 10pM per 24h e 72h è stata effettuata mediante il saggio Cell Death Detection ELISA Plus Kit. I valori di assorbanza sono stati espressi come percentuale di apoptosi rispetto alle cellule di controllo. Inoltre sulla linea endoteliale e su quella tumorale 8305C è stato valutato il livello di interazione (sinergismo, additività o antagonismo) tra il composto CLM3 e SN-38 (metabolita attivo dell’Irinotecano); mediante il metodo dell’Indice di Combinazione (CI), dopo 72h di trattamento ad una concentrazione molare fissata con rapporto di 1:1; CLM3 (0,01-100µM) più SN-38 (0,01-100µM).
Al fine di valutare le basi molecolari dell’attività antiproliferativa e proapoptotica di CLM3 sulla linea HMVEC-d, la modulazione dell’espressione genica e della quantità di ciclina D1 attraverso real-time PCR e kit ELISA, rispettivamente, e i livelli di fosforilazione di ERK 1/2, Akt, VEGFR-2, EGFR e RET sono stati misurati mediante kit ELISA. E’ stata inoltre valutata sempre mediante kit ELISA la modulazione dei livelli di VEGFR-2 e EGFR sulle cellule HMVEC-d dopo trattamento per 72h con i composti CLM94 e CLM100 Dai risultati ottenuti CLM3 ha dimostrato un forte effetto antiproliferativo con una IC50, cioè con una concentrazione inibente il 50% delle cellule, di 0,40±0,22 nM ed un effetto proapoptotico concentrazione dipendente sulle cellule endoteliali. Il composto si è dimostrato essere sinergico quando associato a SN-38. I livelli di fosforilazione di EGFR, di RET e di VEGFR diminuiscono significativamente nelle cellule endoteliali dopo il trattamento con CLM3, così come diminuiscono i livelli di fosforilazione di VEGFR e EGFR quando trattati con CLM 100 e CLM94 se comparati al controllo, ed anche la fosforilazione di ERK1/2 e di Akt è significativamente inibita da una bassa concentrazione dei derivati pirazolopirimidinici nelle cellule endoteliali. Inoltre, il trattamento con CLM3 inibisce l’espressione del gene della ciclina D1 nelle cellule endoteliali, diminuendo la concentrazione della proteina ciclina D1 intracellulare.
In conclusione i derivati pirazolo-pirimidinici e saccarinici mostrano un’attività antiproliferativa e proapoptotica altamente significativa e promettente, da soli e in combinazione con SN-38, sulle cellule endoteliali e tumorali. In particolare CLM3, inibendo le TK associate a EGFR, VEGFR e RET, inibisce la via di trasduzione del segnale fino all’inibizione della replicazione cellulare.