• carcinomi sincroni
• colon
• colorectal
• gene KRAS
• gene BRAF

1. RIASSUNTO

Introduzione
Nei paesi occidentali il tumore del colon-retto (CRC, Colon Rectal Cancer) rappresenta la terza causa di morte dovuta a neoplasie maligne. Ad oggi gli studi condotti su CRC hanno riportato che una piccola percentuale di essi, che varia dall’ 1-7%, è rappresentata da CRC sincroni, definiti come 2 o più carcinomi primitivi riscontrati nello stesso individuo al momento della prima diagnosi.
Sebbene negli ultimi anni si è assistito ad un aumento dell’incidenza dei tumori del colon-retto, è stata comunque riscontrata una concomitante diminuzione della mortalità ad esso dovuta, attribuibile soprattutto ad una adeguata prevenzione, ad una diagnosi precoce e all’utilizzo di terapie farmacologiche mirate, il cui sviluppo è stato possibile grazie ad una conoscenza più approfondita della biologia di tali tumori. Infatti per il trattamento dei CRC, negli ultimi anni sono state messe a punto terapie farmacologiche mirate basate sulla somministrazione di anticorpi monoclonali (mAb) rivolti verso il recettore per il fattore di crescita epiteliale (EGFR), il quale controlla la cascata di trasduzione del segnale Ras-RAF-MAP-Kasi, mediante l'attivazione di diversi effettori molecolari, tra cui KRas e BRAF, ed è risultato essere iper-espresso in una elevata percentuale di CRC in stadio avanzato.
Tuttavia, il trattamento con mAb anti-EGFR è risultato essere efficace soltanto nel 10-20% dei casi. A questo riguardo, studi recenti hanno dimostrato che la resistenza a tale trattamento può essere associata alla presenza di mutazioni a carico dei geni KRas e BRAF, per i quali sono state riportate frequenze di mutazione del 30-40% e del 5-15% rispettivamente. Tali mutazioni determinano l'attivazione costitutiva delle proteine da essi codificate, con conseguente induzione della cascata Ras-RAF-MAP-Kasi, indipendentemente dalla stimolazione del recettore EGFR. Alla luce dei risultati sopra riportati, la determinazione dello stato mutazionale di tali geni ha assunto un ruolo essenziale nell'identificazione dei pazienti affetti da carcinoma del colon-retto che possono essere trattati con gli mAb anti-EGFR.

Obiettivo
L'obiettivo del mio studio è quello di analizzare la distribuzione delle mutazioni a carico dei geni KRas e BRAF in pazienti affetti da tumore sincrono del colon, per valutare l’eterogeneità di tali tumori e stabilire, inoltre, se per questi pazienti sia sufficiente eseguire l’analisi mutazionale su uno solo dei tumori o su tutti quelli presenti al momento della diagnosi.

Materiali e Metodi
L’analisi mutazionale dei codoni 12 e 13 dell'esone 2 del gene KRas e dell'esone 15 del gene BRAF è stata eseguita su 31 pazienti affetti da CRC sincroni, selezionati da una casistica consecutiva di 500 casi (6%), operati presso la chirurgia dell’Azienda-Ospedaliera-Universitaria Pisana e diagnosticati presso l’Anatomia Patologica III dello stesso presidio ospedaliero, nel periodo compreso tra il 2006- 2009. Il DNA da analizzare è stato estratto da tessuto tumorale fissato in formalina ed incluso in paraffina (FFPE), mediante macrodissezione manuale. Successivamente, gli esoni di interesse sono stati amplificati mediante PCR, e l'analisi mutazionale è stata eseguita utilizzando le tecniche di SSCP e di sequenziamento genomico diretto.

Risultati
L’analisi mutazionale dei codoni 12 e 13 dell'esone 2 del gene KRas e dell'esone 15 del gene BRAF è stata eseguita su una casistica di 31 pazienti affetti da CRC sincroni, per un totale di 70 tumori. Dal punto di vista biologico, lo stato mutazionale del gene KRas è risultato essere omogeneo in 14 pazienti, risultati tutti wild-type, (45%,14/31), ed eterogenei in 17 pazienti (55%, 17/31). Di questi ultimi, in 14 pazienti è stata riscontrata la presenza contemporanea di tumori wild-type e tumori mutati, e in 3 pazienti i tumori presenti avevano mutazioni diverse.
Lo stato mutazionale del gene BRAF, invece, è risultato essere omogeneo in 29 pazienti (94%, 29/31), dei quali 27 hanno riportato tutti i tumori wild-type e 2 hanno riportato tutti i tumori mutati, ed eterogeneo in 2 pazienti (6%, 2/31), caratterizzati dalla presenza contemporanea di tumori wild-type e tumori mutati.

Conclusioni
Dai risultati ottenuti nello studio da me condotto è possibile osservare che un’elevata percentuale di CRC sincroni (55%, 17/31) ha mostrato uno stato mutazionale eterogeneo per i geni KRas e BRAF. Dunque, in questi pazienti, per definire lo stato mutazionale è necessario condurre l’analisi mutazionale di tali geni su tutti i tumori presenti al momento della diagnosi.