ETD

Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-06272009-183237


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
SITRI, MARTINA
URN
etd-06272009-183237
Titolo
Derivati a struttura pirazolo [3,4-d] pirimidinica: nuovi antagonisti per i recettori A3 dell'adenosina
Dipartimento
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Relatori
relatore Prof.ssa Trincavelli, Maria Letizia
Parole chiave
  • antagonisti A3
  • recettori adenosinici
  • Adenosina
Data inizio appello
16/07/2009
Consultabilità
Completa
Riassunto

Tesi di Laurea:
Derivati a struttura pirazolo [3,4-d] pirimidinica: nuovi antagonisti per i recettori A3 dell’ adenosina.


RIASSUNTO:

Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare, in termini di interazioni ligando-recettore, le relazioni struttura-affinità (SAR) di ligandi di nuova sintesi a struttura pirazolo [3,4-d] pirimidinica nei confronti dei recettori adenosinici.
I recettori adenosinici appartengono alla superfamiglia dei recettori accoppiati alle proteine G e sono formati da 7 domini transmembrana ad -elica. Il loro ligando endogeno, l’adenosina, è un nucleoside purinico ubiquitario, formato da adenina e D (-) ribosio. Attualmente sono conosciuti quattro sottotipi recettoriali denominati: A1, A2A, A2B, A3. I recettori A1 e A3 interagiscono con le proteine Gi e Gq provocando l’inibizione dell’adenilato ciclasi e modulando i livelli intracellulari di calcio, mentre i sottotipi A2A e A2B interagiscono prevalentemente con la proteina Gs provocando un aumento dei livelli di cAMP.
Data l’elevata espressione di tali recettori, sia a livello centrale che periferico, e l’implicazione di tali proteine nell’eziopatogenesi di svariate patologie umane, la ricerca si è notevolmente incentrata verso lo sviluppo e la sintesi di nuovi ligandi affini e selettivi per i diversi sottotipi recettoriali al fine di identificare nuovi potenziali agenti terapeutici. Tra i numerosi ligandi di nuova sintesi descritti in letteratura è riportata una classe di composti antagonisti selettivi per il sottotipo recettoriale A3, con potenzialità terapeutiche nel trattamento dell’asma, di patologie neurodegenerative, nelle situazioni di stress cellulare, come l’ipossia cardiaca o cerebrale, ma anche come agenti citostatici nel caso di tumori gliali.
Tramite la clonazione dei sottotipi recettoriali adenosinici, si è giunti alla determinazione delle caratteristiche molecolari dei loro siti di legame e all’elaborazione di modelli molecolari che riuscissero a razionalizzare il profilo farmacologico dei composti presi in esame.
Il MODELLO MOLECOLARE base dei recettori adenosinici prevede l’esistenza, all’interno del recettore, di diversi punti di ancoraggio, quali: tre aree lipofile denominate L1, L2, L3; una zona planare che accoglie l’anello purinico; quattro siti idrofili, probabilmente quattro residui di istidina, capaci di accettare i protoni del ligando.
La valutazione dell’affinità di composti di nuova sintesi nei confronti dei diversi recettori adenosinici viene effettuata grazie alla metodica del binding radioattivo; tale tecnica prevede l’incubazione di una preparazione di membrane biologiche (membrane ottenute da cellule CHO esprimenti i sottotipi recettoriali A1, A2A, e A3 dell’adenosina), con radioligandi specifici ([3H] DPCPX, [3H] NECA e [125I] IB-MECA, rispettivamente); mediante studi di competizione è possibile calcolare l’affinità di ogni composto per ogni sottotipo recettoriale.
Un certo numero di composti eterociclici sono stati identificati come promettenti per lo sviluppo di antagonisti per il recettore A3, mostrando diversi livelli di potenza e selettività.
I prodotti testati in questa tesi appartengono alla serie dei derivati 2-metil 6-fenil-pirazolo[3,4-d] pirimidinici, sintetizzati nel laboratorio del Dipartimento di Scienze Farmaceutiche del Professor Da Settimo, presso l’Università di Pisa, e sviluppati al fine di ottenere antagonisti A3 altamente potenti e selettivi.
Tra i vari derivati, un buon risultato si è ottenuto introducendo sul gruppo amminico in posizione 4 del nucleo pirazolo-pirimidinico un gruppo benzoilico (LUC1177): l’affinità nei confronti del recettore A3 è nell’ordine del subnanomolare (Ki = 0.6nM), con una selettività nei confronti dei recettori A1 e A2A di circa 50-100 volte inferiore.
Fino a questo momento il derivato più promettente è dato dal LUC1190, che presenta un sostituente 4'-metossibenzoil amminico; esso ha mostrato infatti alta affinità per il sottotipo recettoriale A3 (Ki 0,18 nM), insieme con elevata selettività (i valori di affinità nei confronti dei recettori A1 e A2A sono risultati di 1037 nM e 3179 nM, rispettivamente).
Per questi due derivati, risultati i più affini e selettivi della serie, è stato determinato il profilo farmacologico utilizzando il saggio dell’adenilato ciclasi, in cui si valuta l’effetto inibitorio dei composti sulla produzione di cAMP stimolata da Forskolina.
Il LUC1177 e il LUC1190 non sono risultati capaci di modulare di per sé i livelli di cAMP, ma hanno mostrato la capacità di antagonizzare l’effetto di inibizione dell’adenilato ciclasi dato dall’agonista adenosinico NECA, mostrando, pertanto, un profilo antagonista nei confronti del recettore A3, con valori di IC50 rispettivamente, pari a 0.6 ± 0.1 e 0.18 ± 0.02 nM.
Inoltre l’attività farmacologia dei due derivati è stata valutata indagando il loro effetto sulla proliferazione di cellule tumorali U-87 MG di glioblastoma umano. Secondo quanto riportato recentemente il letteratura, infatti, l’adenosina è presente a livelli significativi nel liquido extracellulare di tumori solidi proprio grazie ai recettori A3, iper-espressi nei tumori; in particolare l’adenosina sembra avere un ruolo importante nella crescita dei tumori. Tali dati suggeriscono, pertanto, che il recettore A3 può rappresentare un utile marker tumorale.
Il saggio di vitalità cellulare è stato eseguito utilizzando la metodica del Trypan Blue: tale colorante è in grado di permeare attraverso la membrana cellulare danneggiata delle cellule morte, conferendo loro la caratteristica colorazione blu; le cellule vive, al contrario, avendo membrana integra, rimangono inalterate al microscopio.
In cellule di glioblastoma umano (U-87 MG) l’agonista A3 (Cl-IB-MECA) è stato in grado di stimolare la proliferazione cellulare; il co-trattamento dell’agonista A3 con LUC1177 o con LUC1190 ha bloccato, in modo concentrazione-dipendente, l'effetto di Cl-IB-MECA, suggerendo il possibile utilizzo di antagonisti selettivi per il recettore A3 nell'intervento farmacologico verso i tumori gliali.



File