• biologia dello sviluppo
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• Xenopus laevis
• Xrx1 and Xenf
• Xrx1 e Xenf

Durante lo sviluppo dell’occhio nei Vertebrati sono necessari una serie di eventi altamente coordinati, tra cui la specificazione della piastra neurale anteriore, l’evaginazione laterale delle vescicole ottiche dal prosencefalo e infine il differenziamento del cristallino e dei vari strati della retina. Tra i geni essenziali per il corretto sviluppo di questo organo un ruolo critico e’ svolto dal fattore di trascrizione di tipo paired-like Rx1.

In Xenopus laevis, Xrx1 è espresso a partire dallo stadio di neurula nella piastra neurale anteriore. Successivamente, la sua espressione si localizza nelle vescicole e nelle coppe ottiche, nel diencefalo ventrale e nella ghiandola pineale. Una volta terminato il differenziamento della retina, la sua espressione nell’occhio si restringe alla zona marginale ciliare, dove è implicato nel mantenimento della staminalità dei progenitori che permettono la rigenerazione dei neuroni retinici.

Nell’ambito di un progetto volto a identificare i geni regolati da questo fattore di trascrizione, sono stati effettuati esperimenti utilizzando i “microarray” commerciali “GeneChip Xenopus laevis genome array”. Grazie a queste tecniche è stato possibile evidenziare i trascritti che cambiano livello di espressione in seguito alla sovraespressione o all’inattivazione funzionale di Xrx1 allo stadio di neurula precoce, e che quindi hanno maggiore probabilità di essere effettivamente controllati da Xrx1 durante lo sviluppo. Tra questi sono stati selezionati trascritti dotati di un comportamento coerente con il piu’ semplice modello ipotizzabile, quindi quelli che rispettivamente aumentano nella sovraespressione e diminuiscono nella inattivazione funzionale, o viceversa.

Lo scopo di questa tesi è di caratterizzare il profilo di espressione dei trascritti selezionati, fornendo così anche una prima conferma dei dati provenienti dagli esperimenti di microarray e, inoltre, di identificare i trascritti analizzati per evidenziare eventuali relazioni funzionali con Xrx1.

Sono stati analizzati undici dei trascritti selezionati. Il profilo di espressione di questi geni è stato studiato mediante ibridazione in situ su embrioni interi a diversi stadi di sviluppo, da nerula precoce a larva natante. Inoltre sono state effettuate ibridazioni in situ su sezioni di retina differenziata a stadio di girino per verificarne la localizzazione, in particolare a livello della CMZ. Dalle analisi su embrioni interi e sezioni di retine è risultato che sette trascritti sono espressi ad alti livelli nell’occhio e nel sistema nervoso centrale anteriore: di questi, quattro sono specificamente localizzati o arricchiti nella zona marginale ciliare. Infine uno dei trascritti selezionati, L11, è localizzato nell’endoderma a stadio di neurula, mentre non risulta trascritto a stadi successivi. Per indagare più approfonditamente sulla sua eventuale interazione con Xrx1 sono stati effettuati esperimenti di guadagno di funzione sovraesprimendo Xrx1 e analizzando l’espressione di L11 a stadio di neurula. Inoltre sono state effettuate analisi bioinformatiche di omologia di sequenza e successivamente ricerche in letteratura per tentare di identificare, anche solo parzialmente, i trascritti sconosciuti o inferirne una funzione.

I risultati confermano che, ad eccezione di due trascritti, tutti gli altri hanno domini di espressione parzialmente sovrapposti o riconducibili a quello di Xrx1, e sono quindi dotati della giusta localizzazione per essere effettivamente regolati da Xrx1 durante lo sviluppo. Per mezzo delle indagini bioinformatiche sono stati individuati alcuni trascritti particolarmente interessanti per la funzione svolta in relazione alle attività di Xrx1, ad esempio nel mantenimento della staminalità.