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Tesi etd-06272007-103220


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
Boccardi, Claudia
URN
etd-06272007-103220
Title
Un approccio proteomico nell’individuazione di marcatori precoci dell’attivazione di cellule muscolari lisce di coronaria(VSMC)
Settore scientifico disciplinare
BIO/10
Corso di studi
FISIOPATOLOGIA MEDICA E FARMACOLOGIA
Commissione
Relatore Prof. Nieri, Paola
Relatore Dott. Citti, Lorenzo
Parole chiave
  • VSMC
  • proteomica
  • fattori di crescita
Data inizio appello
30/03/2007;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Il danneggiamento dello strato di cellule endoteliali della parete di vasi coronarici innesca una serie di eventi a cui contribuiscono ormoni vasoattivi, citochine e fattori di crescita, i quali inducono l’attivazione delle cellule muscolari lisce (SMC). Questa attivazione si traduce in fenomeni di proliferazione e migrazione di queste cellule che può determinare l’occlusione del vaso. <br>Le cellule muscolari lisce vascolari (Vascular smooth muscle cells (VSMC)) sono cellule <br>differenziate che mantengono tuttavia una grande plasticità. Questa prerogativa è alla base di una loro particolare sensibilità a quegli stimoli che inducono la proliferazione e la migrazione. <br>In condizioni fisiologiche le cellule muscolari lisce vascolari presentano un fenotipo quiescente, caratterizzato dall’ espressione dei geni dell’apparato contrattile e conseguente attività contrattile, ciclo cellulare bloccato in Go e ridotta sintesi di matrice extracellulare. In seguito all’attivazione da parte dei fattori del siero, esse possono assumere un fenotipo sintetico, caratterizzato dalla perdita di attività contrattile, che porta alla comparsa della attività proliferativa,alla sintesi di matrice extracellulare e quindi alla migrazione. <br>Questa modulazione fenotipica è stata riprodotta in vitro anche nel nostro laboratorio con colture primarie di cellule muscolari lisce di arteria di maiale. Queste cellule, coltivate in condizioni standard in presenza del 10% di siero fetale bovino, proliferano e presentano un fenotipo attivato(sintetico). Queste stesse colture, una volta deprivate del siero, perdono la capacità proliferativa ed assumo il fenotipo quiescente (contrattile). <br>La possibilità di riprodurre in vitro la modulazione fenotipica reversibile delle cellule muscolari lisce di arteria rende il nostro modello particolarmente adeguato allo studio e l’individuazione di proteine che, partecipando all’attivazione delle SMC. <br>I fattori di crescita contenuti nel siero, legandosi ai recettori specifici di membrana, ne inducono l’attività tirosin cinasica che a sua volta innesca una serie di fosforilazioni a catena di mediatori proteici. Pertanto, l’attivazione del fenotipo proliferante, sintetico, è legata all’accensione di diverse vie di trasduzione del segnale con il reclutamento di proteine mediatrici ed adattatrici che si fosforilano e si complessano generalmente nei pressi della membrana citoplasmatica. <br>Scopo di questo lavoro di dottorato è stato lo studio proteomico delle modifiche molecolari che promuovono il passaggio delle VSMC dal fenotipo quiescente a quello attivato-proliferante. La proteomica rappresenta la frontiera estrema di acquisizione di informazioni sul fenotipo rappresentativo di un dato stadio della patologia. La proteomica è utile per determinare quali, quante ed in che tempi le proteine si esprimono in relazione ad un determinato stimolo, ed è complementare alla genomica in quanto si focalizza sul prodotto del gene. Per questi motivo abbiamo deciso la sua applicazione alla nostra problematica. <br>In particolare, è stata analizzata la modulazione del contenuto di tirosina fosforilata nelle proteine di cellule VSMC in seguito all’attivazione cellulare indotta da siero o singoli fattori di crescita, come IGF-I (Insulin-like Growth Factor 1, IGF-1) e PDGF-BB (Platelet Derived Growth Factor PDGF-BB). <br>Il confronto degli elettroferogrammi 2D (profili 2D-PAGE) risultanti dalle VSMC quiescenti, contrattili, od attivate-proliferanti, sintetiche, ci ha portato a riscontrare una consistente quantità di differenze nell’espressione proteica. <br>Delle proteine differenzialmente espresse nei due fenotipi, 20 sono stata identificate con tecniche di Spettrometria di Massa e la loro modulazione neil livelli di fosforilazione in tirosina è stato registrata a tempi diversi di stimolazione con il siero (da 0-48 ore). <br>Le proteine identificate sono state suddivise in tre classi omogenee: (a) gli enzimi del metabolismo del glucosio, (b) elementi del citoscheletro, (c) ciaperonine. Altre proteine sono state identificate ma non è stato possibile riunirle in una classe omogenea. <br>Dall’analisi della fosforilazione nell’arco delle 48 ore (time-course), emerge una riduzione del livello di fosforilazione, circa la metà di quello iniziale. Nelle varie classi le variazioni in tirosin-fosforilazione delle proteine, tranne rare eccezioni, hanno un andamento omogeneo. La fosforilazione a 10 minuti dalla stimolazione risulta critica anche nelle varie classi delle proteine identificate, evidenziando un ruolo cruciale degli eventi precoci nell’attivazione delle VSMC. Per questo motivo abbiamo dissezionato il ruolo di singoli fattori di crescita sulla modulazione a 10 minuti del profilo di fosforilazione delle proteine identificate. <br>La differenza più significativa riguarda la classe delle ciaperonine,la cui fosforilazione è diversamente modulata dai singoli fattori di crescita o dal siero. Questa modulazione non è significativo per gli enzimi del metabolismo del glucosio. Mentre quanto concerne gli elementi del citoscheletro non sono stati evidenziate fluttuazioni significative ai tempi precoci, ad eccezione della a-actina, che mostra una marcata diminuzione. <br>Concludendo i nostri risultati indicano che le ciaperonine in generale e le proteine da stress in particolare hanno un ruolo cruciale nei primi stadi del processo di attivazione. <br>
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