• NOSH-ASA

Il tumore al colon-retto è una delle principali cause di decessi per cancro in tutto il mondo. Nei pazienti ad uno stadio tumorale avanzato, l'efficacia di trattamenti attualmente disponibili è limitata. In generale, i farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS), ed in particolare l'aspirina (ASA), sono dei prototipi agenti di chemioprevenzione. Tuttavia, l'uso di FANS è limitato dalla loro tossicità significativa (gastrointestinale, renale e cardiovascolare). Per sviluppare un "FANS migliore", il team del Dr. Kashfi del dipartimento di fisiologia e farmacologia dell’istituto The Sophie Davis School of Biomedical Education- New York- ha sintetizzato dei composti ibridi dell’aspirina che rilasciano ossido nitrico (NO) e idrogeno solforato (H2S), due gasotrasmettitori di rilevanza fisiologica: i “NOSH compounds”. Il composto “lead”, NOSH-ASA, risulta 100000 volte più potente dell’aspirina nell’inibire la crescita delle cellule cancerogene del colon, avendo un IC50 per l’inibizione di crescita cellulare in un range nano-molare. Nonostante la sua elevata potenza, possiede una citotossicità molto limitata dimostrata dalla bassa percentuale (< 10%) di rilascio di LDH nelle 24h per una concentrazione pari a 4 volte la sua IC50. Lo studio in vivo che ho effettuato, presso il laboratorio del Dr. Kashfi, su topi xenograft di cancro al colon umano ha confermato l’efficacia di NOSH-aspirin nel ridurre la massa tumorale in funzione della concentrazione e del tempo.
Oggetto di tesi è la valutazione degli effetti dei NOSH-compounds per il trattamento del tumore al colon e l’individuazione dei target molecolari.
Gli effetti inibitori sulla crescita cellulare di 9 composti NOSH, a concentrazione diversa, sono stati valutati utilizzando il saggio colorimetrico MTT (Kit: Roche, Indianapolis, IN) su linee cellulari HT-29 e HCT 15 di adenocarcinoma del colon umano, coltivate secondo tecniche di coltura cellulare. Ciascuna analisi è stata condotta in triplice copia e l’intero esperimento è stato ripetuto da 3 a 5 volte. Le analisi biostatistiche confermano come tutti i composti siano potenti nell’inibire la crescita di entrambe le linee cellulari. In particolare, le IC50 per l’inibizione di crescita cellulare, in nM nelle 24h, di tre isomeri posizionali di NOSH-aspirin sono: per HT-29 ortho-NOSH-ASA (0.04 ± 0.011), meta-NOSH-ASA (0.24 ± 0.11), para-NOSH-ASA (0.46 ± 0.17); per HCT 15 ortho-NOSH-ASA (0.062 ± 0.006), meta-NOSH-ASA (0.092 ± 0.004), para-NOSH-ASA (0.37 ± 0.04). Ho proseguito valutando la differente efficacia dei tre isomeri posizionali sulla linea cellulare HT-29 di adenocarcinoma del colon umano attraverso ulteriori test biochimici. L’espressione di PCNA, marker di proliferazione cellulare, è stata determinata con il Kit ELISA (Calbiochem, La Jolla, CA); i risultati, analizzati mediante spettrofotometro, dimostrano come NOSH-aspirin inibisca la proliferazione cellulare. Attraverso la tecnica della citometria a flusso, ho effettuato l’analisi della quota di cellule in apoptosi precoce e tardiva in funzione del tempo mediante saggio dell’Annessina-V/Propidio Ioduro (PI) e l’analisi della proporzione di cellule nelle differenti fasi del ciclo cellulare mediante colorazione con PI, evidenziando come NOSH-aspirin induca l’apoptosi e provochi il blocco del ciclo cellulare in fase G0/G1 in modo dose dipendente. Inoltre i livelli intracellulari di ROS sono stati misurati attraverso le sonde molecolari DCFDA (per H2O2 e altri perossidi) e DHE (per l’anione superossido).
I risultati mostrano come tutti e tre gli isomeri posizionali siano efficaci nell’inibire la crescita delle cellule cancerogene del colon, offrendo piattaforme differenti per il “drug design”, ma le loro diverse IC50 incidono sulla potenza di NOSH-aspirin e il “lead compound” è risultato l’ortho-NOSH-aspirin. Con l’utilizzo della tecnica Western blot ho valutato i target molecolari di questo isomero, come P53 e FoxM1, le cui alterate espressioni regolano (in modo negativo e positivo, rispettivamente) la progressione tumorale. Concentrazioni crescenti di ortho-NOSH-ASA risultano aumentare l’espressione di P53, mentre l’espressione di FoxM1 diminuisce, come suggerisce la stessa azione di controllo negativo operata dal gene soppressore tumorale su FoxM1. In conclusione, i risultati dimostrano che NOSH-ASA ha un grande potere inibitorio sulla crescita di cellule cancerogene del colon e merita ulteriori valutazioni.