• BoNT/A

La BoNT/A è una metalloproteasi che blocca il rilascio del neurotrasmettitore a livello del terminale presinaptico, mediante il taglio proteolitico di SNAP-25 (componente del complesso SNARE). Grazie alla sua prolungata attività (alcuni mesi) a livello della sinapsi periferiche (neuromuscolari e nocicettive), la BoNT/A è ampiamente utilizzata in clinica neurologica (per il trattamento delle distonie, della spasticità e delle sindromi dolorose) e nei trattamenti estetici (rimozione delle rughe del volto). Nonostante il largo impiego della BoNT/A, si conosce relativamente poco riguardo il suo traffico intracellulare a livello neuronale. Storicamente si riteneva che gli effetti della BoNT/A rimanessero estremamente localizzati al sito d’iniezione; tuttavia, da studi condotti nel nostro laboratorio sono state evidenziate le capacità della tossina di muoversi in senso retrogrado lungo gli assoni.
In questa tesi ho analizzato il trasporto anterogrado della BoNT/A nei neuroni, sfruttando come modello sperimentale il sistema visivo del ratto, in particolare la proiezione unidirezionale cellule gangliari retiniche ⇒ collicolo superiore. Tre giorni dopo l’iniezione di BoNT/A nell’occhio abbiamo potuto osservare i suoi effetti proteolitici (presenza di SNAP-25 tagliata) a livello del tetto ottico controlaterale all’iniezione, ma non in quello ipsilaterale. Questa specificità di trasporto è in linea con l’organizzazione anatomica della via ottica del ratto, dove il 97% delle fibre retiniche decussa a livello del chiasma. La propagazione anterograda degli effetti proteolitici della BoNT/A veniva bloccata dalla coiniezione con colchicina (un agente in grado di depolimerizzare i microtubuli) dimostrando che la propagazione degli effetti è dipendente dal trasporto microtubulare assonale. Con analisi immunoistochimiche ho osservato una significativa colocalizzazione tra la forma tagliata di SNAP-25 e marcatori presinaptici (sinapsina, V-Glut1, V-Gat); tuttavia non si osserva colocalizzazione con marcatori dei terminali delle cellule gangliari (identificati o con V-Glut2 o con iniezione di un tracciante anterogrado nell’occhio). Quest’assenza di colocalizzazione dimostra che la BoNT/A esercita i suoi effetti tramite un passaggio di transcitosi con cui viene trasferita dai terminali retinici ad altre sinapsi all’interno del tetto ottico. Esperimenti con iniezione sequenziale di BoNT/A nell’occhio e BoNT/E nel collicolo superiore mi hanno permesso di dimostrare che la presenza di SNAP-25 tagliata nel tetto ottico è da attribuire all’attività catalitica locale di BoNT/A. BoNT/E taglia SNAP-25 eliminando il sito d’azione di BoNT/A, ma i suoi effetti persistono per sole due settimane. Sperimentalmente abbiamo notato che al termine dell’effetto proteolitico di BoNT/E, si ha una ripresa dell’azione catalitica di BoNT/A dimostrando quindi che la forma attiva di BoNT/A viene trasportata anterogradamente dalla retina al tetto ottico.
I nostri dati dimostrano il trasporto anterogrado e la transcitosi della forma attiva di BoNT/A. Questi risultati sono importanti per la comprensione dei meccanismi d’azione di questa tossina. In particolare ci sono dati sperimentali che suggeriscono un’azione centrale della BoNT/A (somministrata perifericamente) nella terapia del dolore. I risultati da noi ottenuti indicano che quest’azione centrale potrebbe essere dovuta al trasporto retrogrado lungo la branca periferica dei neuroni nocicettivi, seguito da trasporto anterogrado e transcitosi all’interno del midollo spinale.