• nanofilm
• freestanding
• C2C12

Lo studio delle interazioni tra cellule e materiali di diversa natura ha assunto notevole interesse negli ultimi anni. In particolare, substrati polimerici facilmente manipolabili e resistenti in liquido sono richiesti per procedure di coltura e rigenerazione tissutale, così come per la realizzazione di sistemi bio-ibridi. Da questo punto di vista, nuove strutture polimeriche biocompatibili, rilasciabili in soluzioni biocompatibili (“free - standing”), con features superficiali nanometriche e un’opportuna chimica di superficie, si propongono come ottimi candidati per la realizzazione di substrati per adesione, proliferazione e differenziazione cellulare. La possibilità di controllare i parametri del processo di fabbricazione dei film, allo scopo di modificarne le caratteristiche chimiche e fisiche, rappresenta inoltre un aspetto chiave per quanto riguarda la crescita guidata, la proliferazione e lo spreading cellulare.
Nel presente studio, sono stati realizzati film polimerici ultrasottili free-standing di due tipi: film single layer di acido polilattico (PLA) realizzati mediante tecnica spin coating, e film multilayer di polielettroliti realizzati mediante tecnica layer-by-layer assembly spin-coated assisted, che prevede la deposizione di strati alternati di polielettroliti sfruttando le interazioni elettrostatiche che si instaurano tra un policatione e un polianione. Poly(allylamine hidrochloride) o PAH e Poly(diallyldimethylammonium chloride) o PDDA sono stati utilizzati come policationi, Poly(sodium 4-styrenesulfonate) o PSS come polianione.
I diversi substrati sono stati caratterizzati misurandone la rugosità superficiale e lo spessore.
Il modello cellulare scelto è la linea di cellule muscolari scheletriche di topo C2C12. Queste, una volta differenziate in miotubi mediante opportuni stimoli chimici, presentano proprietà contrattili che possono essere utilizzate per l’attuazione di dispositivi polimerici: sono infatti in grado di convertire stimoli elettrici forniti dall’esterno in energia cinetica, contraendosi.
Tali cellule sono state seminate su ciascun film, seguendo una procedura standardizzata, ed è stata valutata la biocompatibilità e l’adesione a breve termine eseguendo il test Live/Dead che consente di identificare mediante colorazione in fluorescenza le cellule vive e quelle morte sulla superficie del campione, sulla base dell’integrità della membrana e dell’attività esterasica.
Per una ulteriore valutazione della biocompatibilità, e al fine di quantificare la proliferazione e la vitalità delle cellule sui differenti substrati, è stato effettuato un test per la proliferazione cellulare a 72 ore mediante quantificazione del dsDNA contenuto all’interno delle cellule e il test wst-1 per la quantificazione del metabolismo cellulare. Entrambi i test si basano su saggi colorimetrici che permettono una lettura allo spettrofotometro dell’assorbanza emessa, che riconduce direttamente e in maniera quantitativa alla proliferazione e al metabolismo cellulare. Le cellule muscolari scheletriche sono state poi fatte differenziare ed è stata valutata l’organizzazione delle fibre di stress (α-actina), del citoscheletro e il nucleo cellulare a 3 e 7 giorni dall’inizio della differenziazione, mediante l’utilizzo di coloranti specifici tipici dell’immunofluorescenza (Oregon green 488-phalloidin e Dapi).
I film polimerici ultrasottili free-standing biocompatibili precedentemente descritti, utilizzati come substrati per la crescita cellulare, risultano essere quindi ottimi candidati per numerose applicazioni nei campi della medicina rigenerativa e dell’ingegneria tissutale, ma anche per la realizzazione di dispositivi bio-ibridi. Inoltre, al fine di realizzare substrati che permettano la crescita guidata di strutture cellulari specifiche, le diverse tipologie di film potranno essere ingegnerizzate, impedendo localmente l’adesione cellulare, in modo da ottenere un’adesione selettiva e guidata delle cellule sui substrati. Ciò potrà essere ottenuto funzionalizzando la superficie con pattern specifici di proteine di adesione o variando la topografia del film stesso con pattern fisici ottenuti per microfabbricazione.