• N-acetil-esosammine

Le N-acetil-esosammine, amminozuccheri dove il gruppo ossidrilico in posizione 2 è sostituito con un gruppo N-acetilamminico (CH3CONH-), sono tra i carboidrati più rappresentati nelle macromolecole saccaridiche come, ad esempio, le glicoproteine e i glicolipidi. Questi saccaridi, inseriti in strutture più complesse, sono responsabili di numerosi processi biologi, che vanno dal riconoscimento ed adesione tra cellule fino alla difesa immunitaria e la replicazione virale. Composti di tale struttura sono, quindi, strettamente correlati con lo sviluppo di processi infiammatori, quali l’osteoartrite e l’artrite reumatoide, infezioni virali e batteriche, tumori. Le N-acetil-esosammine più importanti e diffuse in natura, ottenibili dall’idrolisi acida di macromolecole di origine naturale, sono la N-acetil-D-galattosammina (GalNAc), la N-acetil-D-glucosammina (GlcNAc) e la N-acetil-D-mannosammina (ManNAc). Ad esempio, la N-acetil-D-glucosammina è il monosaccaride costituente la chitina; la N-acetil-D-lattosammina (LacNAc), un disaccaride a struttura beta-D-Galp-(1→4)-D-GlcNAc, è un costituente di vari glicoconiugati come gli antigeni dei gruppi sanguigni, il Sialyl-Lewis X e gli oligosaccaridi del latte umano (HMO); la N-acetil-D-galattosammina è un costituente di molte glicoproteine complesse, come le mucine ed i determinanti oligosaccaridici degli antigeni dei gruppi sanguigni umani. Mentre le N-acetil-esosammine GalNAc e GlcNAc sono riconosciute da tempo come dei potenti agonisti del recettore NKR-P1 delle cellule Natural Killer (NK) di ratto, solo recentemente, nell’ambito di una ricerca sviluppata nel Laboratorio dove è stata svolta questa Tesi, è stata dimostrata l’interazione sul sistema immunitario della 1-desossinojirimicina (DNJ), un mimico del D-glucosio dove l’ossigeno piranosico è sostituito da un atomo di azoto. In particolare, è stato evidenziato che sia la DNJ che i disaccaridi a struttura beta-D-TalNAc-(1→4)-DNJ e beta-D-ManNAc-(1→4)-DNJ non solo sono buoni agonisti del recettore NKR-P1 delle cellule NK di ratto, ma si sono dimostrati attivi anche sul recettore CD69 delle NK umane.
Partendo da queste premesse e considerando l’importanza biologica delle N-acetil-esosammine, il mio progetto di Tesi ha riguardato la preparazione, a partire dal lattosio, di derivati disaccaridici contenenti unità GlcNAc e GalNAc come i derivati β-D-N-acetil-lattosamminici e il mimico disaccaridico a struttura beta-D-GalNAc-(1→4)-DNJ.
Le vie sintetiche più dirette per l’introduzione di un sostituente azotato sulla posizione C-2 di uno zucchero coinvolgono generalmente metodi di attivazione di glicali con inserzione di varie funzionalità precursori del gruppo N-acetilammino (azidonitrazione, cicloaddizioni, etc.) e, sebbene questi metodi siano efficienti nel trasferimento dell’azoto sul glicale donatore, implicano ulteriori manipolazioni del gruppo funzionale al C-2 per ottenere il gruppo acetammidico. Per questo motivo, per la preparazione di derivati beta-glicosidici di tipo lattosamminico è stato deciso di effettuare l’acetammidoglicosilazione dell’esa-O-benzil-D-lattale, una reazione, messa a punto dal Prof. David Gin e coll. su glicali monosaccaridici, che permette, attraverso un processo che passa per la formazione di un intermedio alfa-ossazolidinico, di preparere beta-glicosidi aventi una funzionalità 2-N-acetilamminica in modo estremamente efficace e con completa stereoselettività.
Come primo obbiettivo ci siamo prefissati di trasformare il perbenzil lattale, facilmente ottenibile dal peracetil lattosio previa trasformazione in bromuro anomerico seguita da eliminazione riduttiva di HBr con zinco, O-desacetilazione e successiva perbenzilazione, nell’alfa-ossazolidina corrispondente attraverso attivazione elettrofila dell’enoletere con tiantrene bis(triflato), generato in situ per reazione del tiatrene-5-ossido con anidride triflica, seguita da trattamento con N,N-dietilanilina e N-trimetilsilil-acetammide. In queste condizioni, a differenza dei risultati riportati in letteratura per i glicali monosaccaridici, la reazione non è completamente stereoselettiva e si ottiene una miscela delle corrispondenti ossazolidine alfa e beta in rapporto 9:1 (resa complessiva del 46%), dalla quale l'ossazolidina alfa può essere isolata pura mediante flash cromatografia su colonna di gel di silice.
Il trattamento acquoso acido (THF-H2O-AcOH) dell’ossazolidina alfa pura fornisce il corrispondente derivato lattosamminico in resa del 44%; l’apertura dell'ossazolidina alfa con MeOH in presenza di Amberlyst-15 fornisce stereoselettivamente il corrispondente metil beta-glicoside in resa del 34%, e l’apertura dell'ossazolidina alfa in presenza di 3-O-tosil-1,3-propandiolo e CSA fornisce il corrispondente β-O-glicoside in resa del 44%. Quest'ultimo derivato β-glicosidico è stato preparato anche per acetammidoglicosilazione one pot di 4 (procedura classica, senza isolamento dell’ossazolidina intermedia) con una resa però insoddisfacente (solo dell’8%). In tutti i casi l’acetammidoglicosilazione, sia one pot che a due stadi, ha fornito, accanto al desiderato prodotto di β-O-glicosidazione, circa il 15% di prodotto d’idrolisi.

La seconda parte della Tesi ha riguardato la sintesi, realizzata attraverso i seguenti quattro processi chiave, dell’azadisaccaride beta-D-GalNAc-(1>4)-DBJ a partire dal lattosio: a) trasformazione dell’unità D-Galp in D-GalpN3 mediante amminazione con formale ritenzione di configurazione, ovvero doppia inversione di configurazione altamente stereoselettiva; b) elaborazione dell’unità glucosidica a dare il diolo in posizione 5,6; c) ossidazione selettiva del C-5 seguita da esposizione della funzionalità aldeidica a dare il corrispondente derivato aldoesos-5-ulosico; d) costruzione dell’anello piperidinico attraverso una reazione, altamente stereocontrollata, di doppia amminazione riducente intramolecolare (amminociclizzazione) con BnNH2 •HCl e NaCNBH3.
La conversione dell’unità beta-D-Galp, selettivamente deprotetta al C-2’ e facilmente ottenibile dal lattosio per doppia acetonazione con DMP e TsOH, in unità beta-D-talopiranosidica è realizzata secondo una procedura sintetica, riportata in letteratura, che ha previsto inversione di configurazione attraverso la sequenza ossidazione-riduzione. La totale sterereoselettività ottenuta, in termini di formazione del derivato beta-D-Talp (resa 96%), è garantita sia dall’effetto di schermo esercitato dal ponte isopropilidenico sia dallo stereocontrollo anomerico, che dirigono l’attacco dell’idruro sulla faccia α meno impedita del doppio legame C=O, favorendo così la formazione esclusiva dell’alcol a configurazione 1,2-cis.
La trasformazione di questo alcol nel corrispondente imidazilsolfonato, seguita da inversione di configurazione stereoselettiva per reazione SN2 con NaN3, rimozione selettiva della funzione metossiisopropilica e successiva benzilazione al C-6’, consente di ottenere il precursore necessario per i successivi passaggi sintetici (resa complessiva del 71%) che, sottoposto a deisopropilidenazione selettiva con AcOH aq all’80%, fornisce il corrispondente tetraolo in resa del 68%. Visto che l’ossidazione regioselettiva al C-5 di 10, mediante formazione di un intermedio 5,6-stannilidenacetalico (1.1 eq. di Bu2SnO, toluene) seguita da apertura ossidativa con NBS (1.0 eq., CHCl3), fornisce il corrispondente 5-cheto derivato in bassa resa (28%), la sequenza sintetica si è indirizzata verso la sintesi del diolo in 5,6, facilmente ottenibile per selettiva acetonazione del tetraolo in posizione 5,6 (2-metossipropene, PyH+TsO-) seguita da benzilazione (BnBr, NaH in DMF) in 3’,4’ e rimozione selettiva del gruppo 5,6-O-isopropilidenico (AcOH aq 80%).
L’ossidazione regioselettiva al C-5 del diolo in 5,6, con NBS, del corrispondente acetale stannilidenico fornisce il chetone che, sottoposto a deprotezione per idrolisi acida blanda (CF3COOH aq 90%), consente, oltre alla rimozione del gruppo 2,3-O-isopropilidenico residuo, l’esposizione della funzione aldeidica, ottenendo così il dicarbonilico la cui struttura, vista la complessità degli spettri NMR (1H e 13C) per la presenza di più forme tautomeriche, è stata indirettamente provata dalla successiva reazione di doppia amminazione riducente. La reazione, condotta con il cloridrato di BnNH2 e NaCNBH3 in MeOH, ha fornito, con completa stereoselettività, l’atteso azadisaccaride a configurazione D-gluco, isolato in resa del 58%. Il derivato così ottenuto è stato, infine, sottoposto a reazione di riduzione dell’azide (NiCl2 x 6H2O, NaBH4 in MeOH), seguita da N-acetilazione (MeOH-Ac2O 4:1 v/v), a dare un azadisaccaride dove l’acetilazione dell’OH-6 può essere spiegata ammettendo, in queste condizioni, l’acetilazione dell’azoto piperidinico seguita da trasferimento dell’acile sul vicino ossidrile. La desacetilazione di questo composto (MeONa-MeOH 0.33 M), seguita da debenzilazione catalitica (H2, Pd/C) condotta in MeOH in presenza di HCl, fornisce il desiderato azadisaccaride completamente deprotetto isolato come cloroidrato.
Con l’ottenimento dei derivati della N-acetil-lattosammina per acetammidoglicosilazione diretta dell'esa-O-benzil-D-lattale, mai riportata in letteratura, e dell’azadisaccaride a struttura beta-D-GalNAc-(1>4)-DNJ sono stati raggiunti gli obbiettivi prefissati in questo lavoro di Tesi. L’azadisaccride sarà inviato, insieme al diastereoisomero a struttura beta-D-GlcNAc-(1→4)-DNJ preparato in ricerche parallele, al Prof. V. Kren dell’Accademia Ceca delle Scienze (Praga), che li testerà come agonisti dei recettori NKR-P1 e CD69 delle cellule NK, rispettivamente di ratto e umane.