• cloruro intracellulare
• pH intracellulare
• sonda proteica
• E2GFP

Un’importante applicazione delle proteine fluorescenti è il loro utilizzo come indicatori di processi biologici, quali la concentrazione dei metaboliti o l’attività enzimatica.
Tali sonde proteiche rappresentano una valida alternativa agli indicatori fluorescenti organici, grazie alla possibilità di essere inserite all’interno della cellula mediante trasferimento genico (e non con immersione o iniezione) e di essere indirizzate in vari compartimenti subcellulari mediante fusione con specifiche sequenze di localizzazione.
In questo lavoro di tesi viene descritta un nuova sonda proteica, denominata E2Red, per la misura combinata del cloruro e del pH. Essa è costituita da un mutante della proteina GFP, E2GFP (F64L, S65T, T203Y) sensibile alla concentrazione del cloruro e al pH, e da una proteina rossa, la DsRed monometrica, la cui fluorescenza è indipendente da entrambi i parametri e funge da elemento di normalizzazione.
Nella prima fase di questo lavoro mi sono concentrata sulla taratura in vivo di E2Red, costruendo curve di calibrazione, sia per il cloruro che per il pH. Inoltre ho utilizzato E2Red per effettuare misure statiche e dinamiche del cloruro e del pH intracellulari. Infine ho mostrato come, fondendo al biosensore una sequenza codificante per i primi 20 amminoacidi della proteina di membrana GAP43, è possibile ancorare selettivamente E2Red sulla membrana citoplasmatica .