• Biofilm
• Cellule mononucleate di sangue periferico umano
• Peripheral blood mononuclear cells
• Pseudomonas aeruginosa
• Staphylococcus epidermidis

RIASSUNTO
Il concetto di biofilm è relativamente recente ed è riferito a comunità microbiche costituite da cellule adese in maniera stabile ad un substrato e/o le une alle altre ed immerse in una matrice di polimeri extracellulari di natura complessa che esse stesse hanno prodotto. I biofilm rappresentano la principale modalità di crescita dei batteri, sia nell’ambiente naturale che nell’ospite in quanto rappresentano un vantaggio evolutivo per i microrganismi che li compongono; in questa modalità di crescita, infatti, essi risultano protetti da agenti chimici e fisici, dal sistema immunitario dell’ospite e dall’azione di antibiotici e disinfettanti.
I batteri produttori di biofilm rivestono una notevole rilevanza medica in quanto si stima che siano responsabili di più dell’80% delle infezioni nell’organismo umano, contribuendo significativamente alla morbilità e alla mortalità, specialmente in ambiente ospedaliero. Nell’ospite, la formazione di un biofilm può avvenire sia su superfici biotiche (mucose, epiteli, tessuti) sia su superfici abiotiche quali i dispositivi medici (cateteri venosi centrali, cateteri urinari, valvole cardiache, protesi ortopediche, lenti a contatto, protesi dentarie) il cui uso nella moderna pratica clinica è sempre più frequente.
Mentre le fasi di sviluppo di un biofilm sono abbastanza conservate in diverse specie batteriche, esistono notevoli differenze tra biofilm maturi di specie diverse, o addirittura di ceppi diversi all’interno della stessa specie, per quanto riguarda l'architettura, la composizione chimica o i sistemi di comunicazione intercellulare (Quorum-sensing). Oltre alle differenze specie o ceppo-dipendenti tra i biofilm di batteri patogeni, diverse proprietà distinguono anche i biofilm dalle corrispondenti cellule planctoniche. Tra queste citiamo il tasso di crescita, l'attività metabolica, la tolleranza agli stress ambientali, la disponibilità di nutrienti, la composizione chimica e l'espressione genica globale che ha dimostrato di differire notevolmente tra le colture planctoniche ed i loro corrispondenti biofilm.
La crescente frequenza delle infezioni da biofilm e la loro straordinaria resistenza agli antibiotici, evidenzia l'importanza di comprendere la risposta immunitaria dell'ospite ai biofilm, nell’ottica di sviluppare nuovi approcci (immuno)-terapeutici per la gestione di infezioni biofilm-correlate. Nonostante i progressi compiuti in questo campo nell'ultimo decennio, la comprensione della risposta immunitaria ai biofilm microbici è solo ad uno stadio iniziale.
In tale contesto, lo scopo della presente tesi sperimentale è stato quello di confrontare la risposta immunitaria di cellule mononucleate di sangue periferico umano (PBMC) evocata in vitro da batteri patogeni in forma di biofilm o di cellule planctoniche. In particolare, sono stati presi in considerazione due patogeni opportunisti tra i principali produttori di biofilm, Pseudomonas aeruginosa, particolarmente rilevante nei soggetti affetti da fibrosi cistica e Staphylococcus epidermidis coinvolto principalmente in infezioni di pazienti sottoposti a cateterismo endovascolare.
A tale scopo, le PBMC sono state purificate da sangue periferico di donatori sani mediante Lympholyte®-H e poste ad incubare con biofilm pre-formato e cellule planctoniche in fase di crescita esponenziale di entrambe le specie batteriche. Dopo 24 ore di incubazione è stato raccolto il sopranatante di coltura per la determinazione delle citochine mediante LEGENDplex™ Multi-Analyte Flow Assay Kit. Le PBMC, invece, sono state risospese in una soluzione salina per l’immuno - staining dei marker di attivazione e di quelli identificativi di varie sottopopolazioni cellulari. Inoltre, sono state acquisite le immagini dei biofilm a 24 e 48 ore, mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM) per ottenere informazioni sulla struttura tridimensionale e l’architettura dei biofilm stessi.
I risultati ottenuti hanno evidenziato interessanti differenze nel pattern di attivazione e nelle citochine prodotte a seconda della specie e/o della modalità di crescita batterica (biofilm rispetto a colture planctoniche). In una prima fase del lavoro di tesi, sono stati eseguiti esperimenti preliminari per l’individuazione delle condizioni di coltura ottimali che assicurassero un numero paragonabile di cellule batteriche tra biofilm e forma planctonica nell’ambito della stessa specie e la vitalità delle PBMC per almeno 24 ore di coltura.
L’attivazione cellulare è stata valutata in citometria a flusso attraverso l’espressione della molecola CD69, un marker precoce di attivazione cellulare espresso dai linfociti T e dalle cellule NK; i dati ottenuti hanno dimostrato che dopo 24 ore di coltura con i batteri planctonici od in forma di biofilm le PBMC risultavano attivate anche se con alcune differenze tra le due specie analizzate. In particolare, mentre in risposta a P. aeruginosa il 20% delle cellule risultava attivato sia nei confronti del biofilm che delle cellule planctoniche, nel caso di S. epidermidis, la forma planctonica induceva un grado di attivazione statisticamente più elevato rispetto al biofilm (25% c.a. versus 15% c.a.; P<0.01).
L’immuno-staining dei marker di superficie ha dimostrato che per entrambe le specie batteriche circa il 10% delle cellule attivate erano linfociti T mentre la stragrande maggioranza delle cellule CD69+ erano cellule NK (CD56+/CD3-), un particolare subset di cellule dell’immunità innata presente nel sangue periferico. Per quanto riguarda i linfociti B (CD19+), la loro percentuale incrementava in maniera statisticamente significativa in risposta ad entrambe le specie batteriche.
I livelli di citochine nei sopranatanti di coltura hanno mostrato una tendenza inversa per le due specie batteriche. Nel caso di P. aeruginosa, il biofilm ha stimolato maggiormente le citochine pro-infiammatorie (TNF-alfa, IL-1beta, IFN-gamma, IL-6) ed anti-infiammatorie (IL-10) rispetto alla controparte planctonica. Nel caso di S. epidermidis è risultata, invece, la forma planctonica quella maggiormente capace di stimolare la produzione di citochine pro- infiammatorie rispetto al biofilm.
Successivamente, allo scopo di spiegare tali differenze, abbiamo proceduto alla caratterizzazione della struttura tridimensione dei biofilm, per entrambe le specie batteriche. I dati della microscopia confocale (CLSM) hanno mostrato una struttura più spessa e più compatta del biofilm ed un contenuto di matrice per cellula più elevato (rapporto cristal violetto/CFU) nel caso di S. epidermidis rispetto ai biofilm di P. aeruginosa. Sebbene preliminari, le immagine live dell' interazione delle PBMC con i biofilm, ottenute mediante il sistema Operetta CLS High-Content Analysis System del Center for Instrument sharing dell’Università di Pisa (CISUP), supportano questa ipotesi, dimostrando un maggior numero di cellule che riescono a penetrare nel biofilm di P. aeruginosa rispetto a quello di S. epidermidis.
I risultati fino a qui ottenuti, ci permettono di elaborare delle ipotesi sul ruolo della risposta immunitaria dell’ospite nel corso delle infezioni sostenute da P. aeruginosa e S. epidermidis. L’intensa risposta infiammatoria evocata dal biofilm di P. aeruginosa, rispetto alla forma planctonica, potrebbe contribuire in vivo ad un esteso danno tissutale permettendo al batterio di ricavare nutrienti e persistere a lungo nei tessuti dell’ospite come si verifica ad esempio nel polmone dei soggetti affetti da fibrosi cistica. Per S. epidermidis, al contrario, la modalità di crescita in biofilm potrebbe permettere al batterio di evadere la risposta pro-infiammatoria/immunitaria dell’ospite utilizzando come porta d’accesso i cateteri venosi centrali che potrebbero così rappresentare il punto di partenza per una eventuale disseminazione sistemica dell'infezione.

SUMMARY
The idea of biofilm is relatively new and refers to microbial communities made up of cells stably attached to a substrate and/or to each other and immersed in a matrix of extracellular polymers of a complex nature that they themselves have produced. Biofilms represent the main mode of growth of bacteria, both in the natural environment and in the host as they provide biofilm member with an evolutionary advantage. In fact, in this mode of growth bacteria are largely protected from chemical and physical agents, host's immune system and disinfectants.
Biofilm-producing bacteria are of considerable medical importance as it is estimated that they are responsible for more than 80% of infections in the human body, significantly contributing to morbidity and mortality especially in hospital setting. In the host, the formation of a biofilm can occur both on biotic surfaces (mucous membranes, epithelia, tissues) and on abiotic surfaces such as medical devices (central venous catheters, urinary catheters, artificial valves, orthopedic prostheses, contact lenses, dental prostheses) whose use in modern clinical practice is increasingly frequent.
While the developmental stages of a biofilm are fairly conserved in different bacterial species, there are notable differences between mature biofilms of different species, or even between different strains within the same species, in terms of architecture, chemical composition or intercellular communication systems (Quorum-sensing). In addition to the species or strain-dependent differences between the biofilms of pathogenic bacteria, several properties also distinguish the biofilms from the corresponding planktonic cells. These include growth rate, metabolic activity, tolerance to environmental stresses, nutrient availability, chemical composition and global gene expression, which has been shown to differ significantly between planktonic cultures and their corresponding biofilms.
The increasing frequency of biofilm infections and their extraordinary resistance to antibiotics highlights the importance of understanding the host's immune response to biofilms, in order to develop new (immune) -therapeutic approaches for the management of biofilm-related infections. Despite the advances in this field over the past decade, understanding the immune response to microbial biofilms is only at an early stage.
In this context, the aim of the present experimental thesis was to compare the immune response of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) elicited in vitro by pathogenic bacteria in the form of biofilm or planktonic cells. In particular, two opportunistic pathogens were considered among the main producers of biofilms, Pseudomonas aeruginosa, particularly relevant in subjects with cystic fibrosis and Staphylococcus epidermidis mainly involved in infections of patients undergoing endovascular catheterization.
For this purpose, PBMCs were purified from peripheral blood of healthy donors using Lympholyte®-H, and incubated with pre-formed biofilms or exponentially growing planktonic cells of both bacterial species. After 24 hours of incubation, the culture supernatant was collected for cytokine determination using the LEGENDplex ™ Multi-Analyte Flow Assay Kit while the PBMCs were resuspended in saline for immuno-staining of cell-surface and activation markers. In addition, images of biofilms at 24 and 48 hours were acquired using confocal laser scanning microscopy (CLSM) to obtain information on the three-dimensional structure and architecture of the biofilms themselves.
The results obtained showed interesting differences in the activation pattern and cytokines production according to the species and/or the bacterial growth modality (biofilm compared to planktonic cultures). In a first phase of the thesis work, preliminary experiments were performed to identify the optimal culture conditions that ensured a comparable number of bacterial cells between biofilm and planktonic form within the same species and the viability of PBMCs for at least 24 hours of culture.
Cell activation was evaluated by flow cytometry through the expression of the CD69 molecule, an early marker of cellular activation expressed by T lymphocytes and NK cells. The data obtained showed that after 24 hours of culture with planktonic bacteria or biofilms the PBMCs were activated even if with some differences between the two bacterial species analyzed. In particular, while in response to P. aeruginosa 20% of the cells were activated against both the biofilm and the planktonic cells, in the case of S. epidermidis, the planktonic form induced a statistically higher degree of activation than the biofilm (25 % c.a. versus 15% c.a.; P <0.01).
The immuno-staining of the surface markers showed that for both bacterial species about 10% of the activated cells were T lymphocytes while the vast majority of CD69+ cells were NK cells (CD56 +/CD3-), a particular subset of cells from the innate immunity present in peripheral blood. As for B-lymphocytes (CD19+), their percentage increased in a statistically significant manner in response to both bacterial species.
Cytokine levels in the culture supernatants showed an inverse trend for the two bacterial species. In the case of P. aeruginosa, the biofilm stimulated the pro-inflammatory (TNF-alfa, IL-1beta, IFN-gamma, IL-6) and anti-inflammatory (IL-10) cytokines more than the planktonic counterpart did. In the case of S. epidermidis, on the other hand, the planktonic form was the one most capable of stimulating the production of pro-inflammatory cytokines compared to the biofilm.
Subsequently, in order to explain these differences, we proceeded to characterize the three-dimensional structure of the biofilms, for both bacterial species. Confocal microscopy (CLSM) data showed a thicker and more compact structure of the biofilm and a higher matrix per cell content (crystal violet/CFU ratio) in S. epidermidis than in P. aeruginosa. Although preliminary, the live images of the interaction between PBMCs and biofilms, obtained through the Operetta CLS High-Content Analysis System of the Center for Instrument sharing of the University of Pisa (CISUP), supported these observations, demonstrating a greater number of cells penetrating the biofilm of P. aeruginosa compared to that of S. epidermidis.
The results obtained, allow us to develop hypotheses on the role of the host's immune response in the course of infections caused by P. aeruginosa and S. epidermidis. The intense inflammatory response evoked by the P. aeruginosa biofilm, compared to the planktonic form, could contribute in vivo to the extensive tissue damage allowing the bacterium to obtain nutrients and persist for a long time in the host tissues as occurs for example in the lung of subjects with cystic fibrosis. For S. epidermidis, on the other hand, the biofilm growth mode could allow the bacterium to evade the host's pro-inflammatory/immune response, using central venous catheters as the gateway, which could thus represent the starting point for a possible systemic dissemination of the infection.