• Aldoso reduttasi
• ARDI
• Complicanze diabetiche

Il diabete mellito (DM) è una patologia caratterizzata da una disfunzione del metabolismo del glucosio e da iperglicemia. Il diabete di tipo 1 è una malattia autoimmune, caratterizzata da un elevato contenuto di glucosio nel sangue, dovuto ad una carenza di insulina, determinata dalla distruzione delle cellule β del pancreas delle isole di Langherans. Anche il diabete di tipo 2 è caratterizzato da elevati livelli di glucosio nel sangue, dovuti ad una riduzione sia della sensibilità all'insulina che della funzionalità delle cellule β del pancreas. Per quanto riguarda le terapia in uso, quella più efficace è sicuramente quella insulinica.. È stato osservato che un numero significativo di pazienti diabetici, con un buon controllo glicemico, sviluppa ancora le complicanze diabetiche, presumibilmente perché gli agenti ipoglicemici esogeni non imitano strettamente il controllo glicemico fisiologico. In condizioni iperglicemiche, una maggiore concentrazione di glucosio stimola l’enzima Aldoso Reduttasi (ALR2), che porta al metabolismo del glucosio attraverso la via dei polioli. In condizioni fisiologiche l’ALR2 riduce le aldeidi tossiche, come il 4-idrossi-2,3-nonenale (HNE), che sono una delle più importanti conseguenze dell’aumento dello stress ossidativo.Al contrario, in caso di elevati livelli di glucosio cellulare, ALR2 riduce anche il glucosio in sorbitolo, che viene successivamente ossidato a fruttosio. Nel processo di riduzione del glucosio, l’enzima consuma il cofattore NADPH (un importate cofattore coinvolto nella produzione di un importante antiossidante, il glutatione (GSH), con conseguente riduzione di quest’ultimo). Lo stress osmotico dovuto all'accumulo di sorbitolo e allo stress ossidativo dovuto alla diminuzione del rapporto NADPH/NADP+, e la riduzione di NAD+, sono le cause principali delle complicanze diabetiche. L’Aldoso Reduttasi prende quindi parte ai meccanismi di difesa dell’organismo, e per questo motivo recentemente è stato introdotto il concetto di inibitore differenziale (ARDI) come una nuova classe di composti in grado di inibire selettivamente l’attività catalitica dell’enzima a seconda dei substrati specifici da trasformare. Nel presente lavoro di tesi, sono stati testati due nuovi composti di sintesi, RD20 e PE10, rispettivamente inibitore classico dell’aldoso reduttasi (ARI) e inibitore differenziale dell’aldoso reduttasi (ARDI), sulla linea cellulare 661W, ottenuta da retinoblastoma murino, sia in condizioni normoglicemiche che iperglicemiche, in modo tale da mimare le condizioni diabetiche. . È stata valutata la percentuale d’inibizione di ALR2 da parte di questi due composti tramite dei saggi enzimatici. Successivamente, si è cercato di valutare se effettivamente il composto ARDI riporti delle differenze apprezzabili rispetto al composto ARI: per fare ciò, sono stati eseguiti dei trattamenti, in condizioni iperglicemiche, al fine di valutare la vitalità cellulare e l’attivazione di processi apoptotici. Infine, con l’utilizzo della tecnica del Western Blotting, è stata analizzata l’espressione di alcune proteine che partecipano a molti processi fisiologici con un’azione antiossidante, la cui attività ed espressione dovrebbe risultare aumentata o ridotta da PE10 e RD20, e quindi modulare l’elevato stress ossidativo causato dallo stato iperglicemico.I dati ottenuti nel presente lavoro di tesi indicano che l’inibizione di ALR2 risulta essere maggiore nel caso del composto RD20, rispetto al composto PE10. Questo non si ripercuote sulla vitalità cellulare: mentre entrambe le concentrazioni di PE10 mostrano un aumento significativo della vitalità cellulare, RD20, invece, ha una limitata azione sull’aumento della vitalità solo alla concentrazione di 50 µM, e il risultato ottenuto alla concentrazione più alta ci fa ipotizzare un’azione tossica del composto.
Nonostante questo, entrambi i composti mostrano una buona attività come anti-apoptotici. Per quanto riguarda la risposta antiossidante, sia il composto RD20 che PE10 hanno mostrato una tendenza a ripristinare i livelli di Sirt1 come quelli presenti nel controllo normoglicemico; solamente la dose più alta di RD20 presenta livelli di Sod1 paragonabili alla situazione di normoglicemia, mentre i livelli di Sod1 nelle cellule con PE10 risultano paragonabili a quelli del controllo iperglicemico. Questo risultato potrebbe indicare un’azione antiossidante solo per il composto RD20. Il dato è stato confermato anche dal saggio immunoistochimico per Nrf2, dove è visibile una maggiore fluorescenza verde, a livello citosolico, per le cellule trattate con RD20 rispetto a PE10.
Quindi la maggiore attività sull’aumento della vitalità cellulare di PE10 non è da deputare a una attività antiossidante di per sé, ma piuttosto alla capacità di PE10 di mantenere intatta la capacità dell’enzima ALR2 di interagire con le aldeidi tossiche, confermando la sua azione come ARDI.