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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-06242014-151122


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
GIANGRECO, GIOVANNI
URN
etd-06242014-151122
Titolo
ITALIANO Valutazione del ruolo svolto da geni sovraespressi nel mesotelioma tramite tecniche di RNA interference INGLESE Evaluation of up regulated genes in mesothelioma through RNA interference technique
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Relatori
relatore Prof. Landi, Stefano
Parole chiave
  • CCNO
  • CFB
  • gene silencing
  • mesotelioma
  • mesothelioma
  • RNA interference
  • silenziamento genico
  • THBS2
Data inizio appello
21/07/2014
Consultabilità
Completa
Riassunto
RIASSUNTO

Introduzione: Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un raro carcinoma della pleura estremamente aggressivo. L’MPM è ritenuto un tumore occupazionale in quanto è stata ampiamente dimostrata la sua correlazione con l’esposizione all’asbesto. Tale neoplasia presenta una lunga fase di latenza, risulta difficilmente diagnosticabile in fase precoce ed è estremamente resistente ai classici trattamenti terapeutici. Per questo motivo cresce l’interesse per l’individuazione di biomarcatori diagnostici e prognostici.
Lavoro precedentemente svolto: La presente ricerca fa parte di un progetto più ampio il cui scopo è quello di individuare geni differenzialmente espressi tra tessuti di mesotelio sano e patologico. A tal proposito è stata effettuata sia una ricerca bibliografica mirante a raccogliere tutti i lavori di analisi trascrittomica sull’MPM, sia un Data Mining (DM) attraverso programmi bioinformatici. Tra i 931 geni candidati emersi, solo 119 si presentavano deregolati in almeno due studi e rientravano nell’analisi del DM, a denotare una bassa riproducibilità tra differenti lavori. Per questo è stata intrapresa una validazione sperimentale dei 119 geni tramite Real-Time RT-PCR in una serie indipendente di casi e controlli. I geni risultati positivi sono stati ulteriormente validati in 2 linee cellulari di MPM.
Scopo della tesi: Lo scopo della tesi è di studiare se 3 geni precedentemente identificati (CFB, CCNO e THBS2) svolgano un effettivo ruolo nella cancerogenesi dell’MPM.
Materiali e metodi: Sono stati condotti esperimenti di RNA interference su 5 linee cellulari di MPM ed una di mesotelio. Successivamente è stato valutato il fenotipo delle linee cellulari in termini di livelli di espressione dei trascritti e delle proteine (Real Time RT-PCR e Western Blot), apoptosi (Saggio dell’attività caspasica), invasività (Wound Healing Assay), capacità proliferativa (Saggio dell’SRB) e capacità di formare colonie (Colony Formation Assay).
Risultati: CFB sembra non corrispondere al gene guida della malignità di questa neoplasia e la sua up regolazione potrebbe dunque essere definita un epifenomeno; CCNO sembra fungere da oncosoppressore ed una sua deplezione potrebbe in alcuni sotto-modelli tumorali di MPM causare un aumento della proliferazione e della capacità di formare colonie. Infine THBS2 sembra svolgere un ruolo importante nella sopravvivenza ed aggressione tumorale, regolando le adesioni cellula/cellula, cellula/matrice e l’angiogenesi.
Conclusioni: Il lavoro ha confermato l’estrema eterogeneità dell’MPM, la quale rende difficile identificare marcatori specifici e sensibili con alte percentuali che valgano in maniera universale. Di grande interesse il ruolo di THBS2, il quale merita di essere ulteriormente investigato sia dal punto di vista biologico sia come marcatore diagnostico e/o terapeutico.

ABSTRACT

Introduction: Malignant Pleural Mesothelioma (MPM) is an uncommon cancer of the pleural surface. MPM is considered an occupational cancer, as it has been demonstrated a strong correlation with asbestos exposure. This tumor is characterized by i. long latency period between first exposure and the occurrence of the neoplasia, ii. hard early diagnosis, and iii. aggressive phenotype, resistant to classical therapeutic drugs. For this reasons the interest to search new diagnostic and prognostic markers is increasing.
Previous works already done: This work lies within a larger project with the aim of identifying genes differentially expressed between healthy and pathological mesothelium. In this regard a literature research was carried out, to identify studies on MPM trascriptomic analysis; it was also performed a Data Mining (DM) through the use of bioinformatic software programs. Overall 931 genes resulted deregulated in MPM, but only 119 of them were deregulated in at least 2 different publications, confirming a low reproducibility between different studies. For this reason an experimentally validation of the 119 genes was performed through Real Time RT-PCR in a case-control study. The genes resulted up-regulated, in a statistically significant way, were further analyzed in 2 different MPM cell lines.
Aim of the thesis: The purpose of this degree thesis is to investigate whether 3 genes previously identified (CFB, CCNO and THBS2) could play a role in the cancerogenesis of MPM.
Materials and methods: The expression of CFB, CCNO and THBS2 was investigated in a panel of 5 MPM cell lines (Mero-14, Mero-25, IstMes2, NCI-H28 and Ren), and in one normal mesothelial cell line (Met5A), at mRNA and protein levels. Following transient transfections, a series of functional studies were performed. In particular the sulphorhodamine assay to assess cell proliferation, the Caspase luminescence assay to evaluate the apoptosis, and the Colony Formation Assay to investigate on the ability to form colonies. Finally, an in vitro cell migration assay was performed.
Results: As regards the silencing of CFB we did not observe any significant phenotypic changes. CCNO depletion caused an increased proliferation rate and greater colony formation capacity of Ren cells. Finally transient THBS2-silencing caused decreased proliferation rate and reduced colony formation capacity in IstMes2 cells. Moreover, THBS2-siRNA triggered a marked increase in apoptosis in Mero-14 cells.
Conclusions: These results highlight the extreme heterogeneity of MPM and suggest THBS2 as a key molecular target for novel gene-based targeted therapies of cancer.
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