• decellularizzazione
• sferoidi
• solubilizzazione

Il fegato ricopre un ruolo metabolico di primo piano, fondamentale per il corretto funzionamento dell’organismo. Ricreare tessuto epatico funzionale è cruciale per molte applicazioni sia in vitro che in vivo. Le comuni colture statiche bidimensionali (cioè monostrati) rappresentano soltanto una ridotta approssimazione dell’ambiente del tessuto nativo in vivo, pertanto negli ultimi anni la ricerca si è spostata verso colture dinamiche tridimensionali, che utilizzano supporti, detti “scaffolds”, cellularizzati. Uno scaffold tridimensionale ideale deve fornire un substrato adesivo che mimi la complessità della matrice extracellulare del tessuto che si intende ingegnerizzare. Inoltre uno scaffold ideale deve essere ben caratterizzato, riproducibile e facile da fabbricare. Ad oggi vi è interesse nell’utilizzo di matrici extracellulari ottenute decellularizzando tessuti epatici come scaffold biologico per epatociti ed altre cellule del fegato, in quanto è stato dimostrato che epatociti seminati su scaffolds decellularizzati mostrano una maggiore attività metabolica rispetto alle colture monostrato. L’obiettivo di questo lavoro di tesi è quello di creare sferoidi contenenti epatociti, che possano essere utilizzati per lo sviluppo ed il testing farmacologico, nonché per studi di tossicologia. Al fine di riprodurre un ambiente quanto più simile a quello epatico in vivo, sono stati indagati due differenti protocolli di decellularizzazione (utilizzando detergenti sia ionici che non ionici) per ottenere matrice extracellulare da fegato porcino, per poi integrarla in forma solubilizzata all’interno dei suddetti sferoidi. La rimozione dei componenti cellulari è stata confermata colorando le matrici epatiche decellularizzate con Ematossilina-Eosina, mentre il loro contenuto proteico totale è stato analizzato mediante saggio di Bradford e comparato rispetto a quello del tessuto non trattato. Inoltre, il contenuto delle proteine chiave della matrice extracellulare è stato indagato mediante Western Blot per valutare l’aggressività delle procedure di decellularizzazione utilizzate in questo lavoro di tesi.
Successivamente, la matrice identificata come ottimale, sia per il contenuto proteico che per la più conservata struttura intralobulare è stata parzialmente digerita con la pepsina per ottenere una matrice extracellulare epatica in forma solubilizzata.
Una sospensione di HepG2 (linea cellulare di epatociti) è stata aggiunta ad una soluzione di alginato, contenente la matrice extracellulare solubilizzata, per formare sferoidi con cellule incapsulate al loro interno.
Per la realizzazione degli sferoidi è stato utilizzato un sistema automatizzato chiamato SpHyGa (Spherical Hydrogel Generator) sviluppato al Centro di Ricerca “E. Piaggio” (Università di Pisa).
Successivamente, gli sferoidi contenti le cellule HepG2, sono stati mantenuti in coltura cellulare per alcuni giorni, durante la durata degli esperimenti è stata valutata la vitalità degli epatociti, misurando il rilascio dell’enzima lattato deidrogenasi (LDH), e la loro funzionalità misurando la secrezione di urea e di albumina.