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Tesi etd-06242010-120548


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
BONUCCELLI, LUCIA
URN
etd-06242010-120548
Title
Analisi di fattori intrinseci ed estrinseci coinvolti nella biologia delle cellule staminali adulte utilizzando la planaria come sistema modello per studi funzionali in vivo
Settore scientifico disciplinare
BIO/13
Corso di studi
MORFOLOGIA E FUNZIONE NORMALE E PATOLOGICA DI CELLULE E TESSUTI
Commissione
tutor Salvetti, Alessandra
Parole chiave
  • RbAp48
  • planaria
  • PHB2
  • neoblasti
  • interferenza genica
  • cellule staminali
Data inizio appello
06/07/2010;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Lo studio in vivo delle cellule staminali somatiche adulte è spesso problematico nei mammiferi poiché tali cellule sono generalmente rare e difficilmente accessibili. Per questo motivo modelli sperimentali alternativi sono frequentemente utilizzati nell’analisi funzionale in vivo di tutti quei geni la cui espressione è condivisa nel regno animale fra diversi tipi di cellule staminali.<br>Fra questi sistemi modello, le planarie possiedono una popolazione di cellule staminali adulte pluripotenti, i neoblasti, che sono capaci di differenziarsi sia in cellule somatiche che germinali. Questo vantaggio, insieme all’utilizzo di approcci molecolari, cellulari e genomici, e la possibilità di studiare in vivo la funzione genica mediante esperimenti di RNA interference (RNAi), fa delle planarie un sistema modello ideale per lo studio della biologia delle cellule staminali adulte in vivo. <br>I neoblasti sono piccole cellule (5-10 μm) con un grosso nucleo circondato da un sottile strato di citoplasma poco differenziato, ricco di ribosomi liberi e corpi cromatoidi (accumuli di RNA associato a proteine). Sono distribuiti lungo tutto il corpo dell’animale all’interno del parenchima, ad eccezione della regione più anteriore della testa e del faringe, e presentano dei siti preferenziali di accumulo in cordoni longitudinali dorsali. I neoblasti, considerate le uniche cellule proliferanti nelle popolazioni asessuate, sono alla base della straordinaria potenzialità rigenerativa delle planarie, e sono reclutati per il rinnovamento di tutti i tipi cellulari differenziati, sia della linea somatica che di quella germinale. Recenti evidenze indicano che la popolazione dei neoblasti è eterogenea e che esistono diverse sottopopolazioni con distintive proprietà genetiche e/o proliferative. Una sottopopolazione di neoblasti è stata identificata mediante l’isolamento del gene DjPiwi-1, omologo del gene Piwi di Drosophila. I neoblasti che esprimono DjPiwi-1 sono distribuiti esclusivamente lungo il cordone centrale dorsale. La scoperta del gene Djnos, omologo del gene nanos di Drosophila, ha portato all’identificazione di un’altra sottopopolazione di neoblasti che sono considerati i precursori delle cellule germinali e sono localizzati in cordoni nel parenchima dorso-laterale. <br>Un’ulteriore evidenza dell’eterogeneità dei neoblasti è stata fornita dai risultati esposti nella prima parte di questo lavoro di tesi. Planarie intatte sono state sottoposte a diverse dosi di raggi X ed è stato monitorato il destino delle cellule staminali mediante: a) analisi dell’espressione di marcatori specifici dei neoblasti come il gene DjMCM2, il gene DjPiwi-1 e il gene Djnos; b) analisi di marcatori generali di proliferazione cellulare con esperimenti di incorporazione di BrdU e valutazione dell’indice mitotico. Questi esperimenti hanno permesso di individuare sottopopolazioni di neoblasti caratterizzate da diversi livelli di radiotolleranza. Tra queste popolazioni radiotolleranti uno specifico gruppo di cellule, preferenzialmente localizzato in prossimità del sistema nervoso centrale, è in grado di sopravvivere alla dose di 5Gy. Queste cellule radioresistenti iniziano a proliferare, migrano dorsalmente e ricostituiscono tutte le altre sottopopolazioni di neoblasti dimostrando la plasticità e l’interconnessione tra sottopopolazioni differenti di cellule staminali.<br>Un altro vantaggio offerto dalle planarie è che i neoblasti possono essere eliminati mediante trattamento con alte dosi di raggi X (30 Gy), mentre le cellule differenziate non vengono danneggiate alle stesse dosi e tempi di trattamento. La possibilità, quindi, di avere a disposizione animali privi di neoblasti offre il vantaggio di poter comparare il loro profilo trascrizionale con quello di animali wild-type. Utilizzando questo approccio sono stati recentemente identificati numerosi geni specifici dei neoblasti, alcuni dei quali codificano per fattori epigenetici.<br>Dato che numerose evidenze indicano che le modificazioni epigenetiche modulano alcune proprietà delle cellule staminali, nella seconda e terza parte di questo lavoro di tesi, è stata indagata la funzione in vivo del gene DjRbAp48 e del gene DjPHB2. Inizialmente, mediante metodiche di 5’ e 3’ RACE è stata ottenuta la sequenza completa di entrambi i geni. Successivamente, è stata analizzata la loro funzione sia in planarie intatte che in rigenerazione mediante la metodica dell’interferenza genica (RNAi).<br>Il silenziamento in vivo del gene DjRbAp48 è letale sia in planarie intatte che in rigenerazione. Anche se dopo il taglio, i neoblasti si accumulano e proliferano al di sotto dell’epitelio della ferita, gli animali silenziati per DjRbAp48 mostrano difetti nelle capacità rigenerative. Inoltre si ritrovano cellule apoptotiche al di sotto dell’epitelio della ferita negli animali trattati con il dsDjRbAp48. Nelle planarie intatte, nonostante una parziale riduzione nel numero di neoblasti, sono sempre visibili numerosi neoblasti negli animali in cui è stato silenziato il gene DjRbAp48. Parallelamente alla diminuzione dei neoblasti, si osserva una riduzione delle cellule differenziate e la presenza di neoblasti in apoptosi negli animali trattati con dsDjRbAp48. Questi risultati suggeriscono che DjRbAp48 non è coinvolto nel mantenimento dei neoblasti, ma piuttosto nella regolazione del differenziamento della progenie di cellule staminali. Una possibilità è che DjRbAp48 possa controllare l’espressione di geni necessari per il differenziamento alterando l’architettura della cromatina.<br> Il silenziamento di DjPHB2 induce la morte delle planarie sia intatte che in rigenerazione. Mediante l’analisi dell’indice mitotico e l’utilizzo di metodiche di immunofluorescenza, ibridazione in situ whole mount e microscopia elettronica è stato dimostrato che in planarie intatte si ha una rilevante perdita del numero di neoblasti. In particolare, si riducono i neoblasti sparsi nel parenchima e quelli accumulati in cordoni dorsali laterali, mentre rimangono quelli localizzati lungo la linea mediana dorsale del corpo dell’animale.<br>Se le planarie silenziate per l’espressione di DjPHB2 vengono tagliate (prima rigenerazione), gli animali sono capaci di rigenerare. Tuttavia, in questi animali si verifica una riduzione del numero dei neoblasti con una dinamica simile a quella osservata nelle planarie intatte: i neoblasti si riducono progressivamente e si ritrovano, a tempi tardivi, esclusivamente a livello della linea mediana dorsale del corpo dell’animale. Infine, planarie silenziate per l’espressione di DjPHB2 in seconda rigenerazione presentano gravi difetti nella capacità rigenerativa: gli animali in rigenerazione posteriore non sono in grado di formare un blastema rigenerativo, mentre gli animali in rigenerazione anteriore presentano un ritardo rigenerativo e anomalie morfogenetiche rispetto ai controlli. Nonostante negli animali iniettati si verifichi una drastica riduzione del numero di neoblasti, queste cellule sono sempre presenti lungo la linea mediana del corpo degli animali, anche in quelli che non sono in grado di formare un blastema rigenerativo.<br>I dati ottenuti indicano che DjPHB2 è un marcatore di neoblasti. L’analisi dei fenotipi ottenuti suggerisce che DjPHB2 sia coinvolto nel mantenimento dei neoblasti dispersi e di quelli localizzati lungo i cordoni laterali del corpo dell’animale, ma non nel mantenimento dei neoblasti presenti lungo la linea mediana, che si ritrovano sempre negli animali in cui il gene DjPHB2 è stato silenziato. Considerando che l’analisi dell’espressione suggerisce la presenza di DjPHB2 in tutti i neoblasti, anche in quelli localizzati lungo la linea mediana, un’ ipotesi è che DjPHB2 svolga funzioni differenti in cellule diverse. Tuttavia, non è possibile escludere la presenza di una sottopopolazione di neoblasti, presenti lungo la linea mediana del corpo della planaria, che esprima DjMCM2, DjPiwi-1 ma non DjPHB2.<br>In conclusione, i risultati ottenuti suggeriscono, per la prima volta, un ruolo in vivo nella biologia delle cellule staminali adulte sia per DjPHB2 che DjRbAp48. Sebbene siano necessari ulteriori studi per comprendere a quale livello del metabolismo della cromatina questi fattori intervengono, i dati ottenuti suggeriscono che questi geni potrebbero controllare processi come il mantenimento e differenziamento delle cellule staminali adulte tramite modificazioni epigenetiche. Poiché geni che svolgono ruoli fondamentali sono conservati durante l’evoluzione, sarà interessante verificare il ruolo di questi fattori anche in vitro in colture di cellule staminali di mammifero.<br>