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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-06232009-100812


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
PIRAS, MARTINA
URN
etd-06232009-100812
Titolo
Studio in vitro dell'interazione tra DNA di TTV e Toll-like receptor 9
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Relatori
Relatore Prof. Ceccherini Nelli, Luca
Relatore Dott. Maggi, Fabrizio
Parole chiave
  • citochine
  • Toll-like receptor
  • TTV
  • virus
Data inizio appello
20/07/2009
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
20/07/2049
Riassunto
Nel 1997 nel siero di un paziente con epatite post-trasfusionale criptogenica fu scoperto un nuovo virus chiamato TorqueTenoVirus (TTV), prototipo del nuovo genere Anellovirus. Il virione di TTV risulta di piccole dimensioni, privo di involucro esterno, con un genoma a singolo filamento di DNA circolare a polarità negativa. Ad oggi TTV è ancora un virus orfano dato che gli studi sul suo ruolo patogeno sono stati inconcludenti anche perché resi particolarmente difficili dall’elevata prevalenza di TTV nella popolazione generale e dalla frequente cronicizzazione dell’infezione. Tuttavia, visto che TTV infetta cellule mononucleate del sangue periferico attivate e che, in bambini affetti da patologie respiratorie, i titoli del virus correlano inversamente con la percentuale di linfociti T circolanti e positivamente quella dei linfociti B, sembra plausibile che TTV sia in grado di modulare la risposta immune.
Lo scopo che la tesi si propone è quello di indagare le relazioni che TTV instaura con il sistema immunitario dell’ospite. A tal fine è stata studiata l’interazione tra il DNA di TTV e il Toll-like 9 (TLR9), membro della famiglia dei TLRs, recettori fondamentali per la clearance dei patogeni attraverso l’immunità innata e acquisita. In particolare, il TLR9 riconosce specifici motivi CpG non metilati fortemente presenti a livello dei genomi virali. Per questo studio è stato utilizzato un sistema “in vitro” che permette la determinazione dell’espressione genica e della produzione di citochine proinfiammatorie (IL-12, IL-6, IL-10 e IFN-gamma) da parte di cellule di milza di topo, dopo stimolazione con il DNA di TTV.
Il substrato cellulare, scelto in quanto particolarmente ricco di TLR9, è stato stimolato, oltre che col DNA virale, anche con altri induttori fra cui ODN sintetici contenenti motivi CpG e concanavalina A.
I risultati hanno dimostrato come il DNA di TTV sia in grado di indurre incrementi statisticamente significativi di alcune citichine, in particolare di IL-6 e INF-gamma. Da sottolineare come l'incremento d'espressione delle citochine sia dipendente dalle quantità di DNA virale utilizzato. Ciò ha fatto ipotizzare, nell'infezione naturale, un ruolo fondamentale della carica virale. Per confermare i risultati ottenuti son state dosate le citochine prodotte nel sovranatante delle cellule (IL-6, IL-10, INF-gamma). Tale dosaggio ha mostrato un netto incremento di INF-gamma e di IL-6 ma non di IL-4 a seguito della stimolazione con DNA di TTV e/o con ODN, dimostrando come ad un'aumentata espressione del gene corrisponda la produzione della proteina. E' stato inoltre comprovato il coinvolgimento del recettore TLR9 nell'induzione alla produzione di citochine utilizzando la clorochina che opera un blocco selettivo del recettore. I risultati di tale esperimento mostrano come le cellule di milza di topo, stimolate con il DNA di TTV e con ODN, in seguito a pre-tarttamento con clorochina, riducono quasi totalmente l'espressione dell'INF-gamma. Tale effetto invece non è stato osservato quando le stesse cellule, in presenza di clorochina, sono trattate con Con A. Il passo successivo è stato quello di confermare il dato con un metodo più specifico, ossia il silenziamento genico del TLR9, ottenuto mediante la strategia degli RNA- interference. I risultati confermano il dato precedente, indicando chiaramente come la produzione di citochine, sia mediata dall'interazione del DNA di TTV con il recettore Toll-like 9
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