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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-06232008-145852


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
BRESSAN, DARIO
URN
etd-06232008-145852
Titolo
I microRNA accoppiano il ciclo cellulare, il destino differenziativo e il tempo nello sviluppo retinico: studi in vitro
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
NEUROBIOLOGIA
Relatori
Relatore Prof. Cremisi, Federico
Parole chiave
  • cell cycle
  • development
  • microRNA
  • qRT-PCR
  • retina
Data inizio appello
21/07/2008
Consultabilità
Completa
Riassunto
La retina è un eccellente modello per lo studio del sistema nervoso. I diversi tipi cellulari che ne compongono la complessa struttura stratiforme sono generati a partire da progenitori cellulari embrionali multipotenti secondo un ordine evolutivamente conservato, che vede comparire prima le cellule gangliari, incaricate del relay verso il talamo, seguite da interneuroni con funzione integrativa (cellule orizzontali e amacrine), fotorecettori, cellule bipolari e glia. La produzione temporalmente ordinata delle cellule bipolari dipende dall'attivazione sequenziale dei geni homeobox pro-differenziativi vsx1 e otx2 . Questi due geni sono regolati a livello traduzionale da segnali diretti sul 3' UTR del loro RNA messaggero la cui produzione dipende dall'avanzamento e progressivo allungamento del ciclo cellulare dei progenitori ([Decembrini et Al, 2006]).

I microRNA, piccoli oligonucleotidi di circa 20-23 basi di lunghezza in grado di reprimere la traduzione di un RNA messaggero agendo sul 3' UTR, sono implicati in numerosi processi fisiologici, patologici e differenziativi, e appaiono candidati ideali al ruolo di regolatori.
L'obiettivo del mio lavoro, condotto utilizzando come modello di studio l'anfibio Xenopus laevis, è stato l'isolamento di un gruppo di microRNA ciclo-cellulare dipendenti in grado di regolare negativamente l'espressione di vsx1 e otx2. Tali molecole, diminuendo di concentrazione in corrispondenza dell'allungamento del ciclo, funzionerebbero come un “orologio” in grado di accoppiare tempo, proliferazione e destino differenziativo dei progenitori retinici.

Assieme al gruppo di ricerca del dott.Cremisi ho dapprima effettuato uno screening su tutti i miRNA espressi in Xenopus tramite microarray, analizzando estratti di RNA totale prelevati dalla retina di embrioni a stadio precoce (ciclo cellulare rapido) e tardivo (ciclo lento), nonché embrioni sottoposti a trattamenti in grado di modificare la durata del ciclo (bloccandolo in fase S oppure allungandolo) e di alterare (in negativo o in positivo) la produzione di cellule bipolari. Ho individuato una lista di 18 miRNA, espressi ad alti livelli nella retina, presenti in concentrazione differente nelle varie tesi, ed in particolar modo abbondanti nei casi in cui il ciclo era breve, oppure bloccato in fase S, e ridotti nei campioni con ciclo cellulare lungo. Tali lista è poi stata ristretta utilizzando una analisi in silico per individuare i bersagli putativi dei miRNA selezionati sui geni vsx1 e otx2. Il risultato finale è stato un elenco di 4 miRNA (mir-129, mir-155, mir-222 e mir-214) candidati al ruolo di inibitori traduzionali ciclo-dipendenti dei geni del destino differenziativo bipolare.

Ho in seguito convalidato i dati di espressione forniti dai microarray, mettendo a punto e applicando un protocollo di quantificazione tramite qRT-PCR real time. Sono passato quindi a definire il pattern di espressione dei miRNA in esame attraverso esperimenti di ibridazione in-situ su sezioni di occhi completamente formati (st. 42) con sonde oligonucleotidiche modificate (LNA, locked nucleic acid). L'espressione di tutti i quattro i miRNA candidati, convalidando ancora una volta i dati sulla loro espressione, è apparsa confinata all'area del margine ciliare (CMZ), in cui si trovano anche nella retina adulta progenitori retinici indifferenziati, e in alcuni casi alle cellule post-mitotiche più precoci (cellule gangliari), uscite dal ciclo molto prima dell'attivazione dei geni in esame.

Infine ho introdotto per trasfezione in linee cellulari riceventi (HEK 293 e HeLa) alcuni sensori contenenti la proteina fluorescente GFP (sotto il controllo di un promotore costituitivo virale CMV) clonata a monte della sequenza 3' UTR normale o mutata dei geni di interesse. La sequenza 3'UTR dei due geni è infatti è capace di regolare la traduzione di GFP ricalcandoil pattern spaziale e temporale di espressione del gene cui appartiene. Somministrando in contemporanea alle cellule i 4 miRNA selezionati o i loro dominanti negativi (oligonucleotidi 2'-O-metilati) assieme ai sensori e a un reporter controllo che codifica per la proteina rossa fluorescente (RFP), ho quantificato la fluorescenza GFP relativa, osservando che otx2 e vsx1 possono in effetti essere inibiti in modo specifico dai miRNA candidati per cui era stato previsto un bersaglio dall'analisi in silico. Altri risultati ottenuti nel laboratorio in cui ho condotto la tesi hanno dimostrato che la manipolazione dei livelli di espressione di questi miRNA è in grado di replicare o revertire gli effetti sul differenziamento delle cellule bipolari dovuti alla manipolazione del ciclo cellulare.

In conclusione, nel mio lavoro di tesi ho dimostrato che mir-129, mir-155, mir-222 e mir-214 sono espressi nell'occhio di X.laevis, durante la retinogenesi, da cellule progenitrici in attiva proliferazione, e che sono in grado di inibire la traduzione dei geni vsx1 e otx2, impedendo loro di dirigere la cellula verso un destino differenziativo di tipo bipolare. I risultati da me ottenuti suggeriscono inoltre che l'espressione di questi miRNA sia proporzionale alla lunghezza del ciclo cellulare, e che pertanto essi possano comporre una parte fondamentale dell'orologio molecolare che regola la “data di nascita” dei progenitori retinici in base al tempo.

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The retina is an excellent model for the study of the nervous system. The cell types which form its complex and ordered structure are all generated from a common multipotent progenitor cell following a fixed and evolutionary conserved order. Retinogenesis begins with the generation of ganglion cells, which form the thalamic relay, followed by integrative interneurons (horizontal and amacrine cells), photoreceptors, bipolar cells and glia. The temporally ordered production of different cell types depends on the sequential activation of key homeobox genes driving their differentiation, specifically vsx1 and otx2 for the bipolar cells. Vsx1 and otx2 are regulated at the translational level by signals directed against their 3'UTR. The production of these signals dependens on the progression and on the constant lengthening of the cell cycle of progenitors (Decembrini et al., 2006).

MicroRNAs are small nucleotides, 20-23 nucleotides long, capable of inhibiting the translation of a messenger RNA acting on its 3'UTR, and highly involved in physiological, pathological and developmental processes. They are perfect candidates to the role of regulators of retinal differentiation
Aim of my work has been the identification of a group of cell-cycle dependent miRNAs that are capable of inhibiting vsx1 and otx2 translation in Xenopus laevis. Decreasing in concentration during cell-cycle lengthening, these molecules could act as a “clock” matching time, proliferation and cell fate of retinal progenitors.

Together with dr. Cremisi research group, I made a screening of all the miRNAs annotated in Xenopus by means microarrays. I analyzed total RNA extracts from the retina of either early (fast cell cycle) or late (slow cycle) embryos, or from retinas of embryos treated with drugs that alter the cell cycle length. Drugs blocked cell cycle in S-phase (hydroxyurea/aphidicoline) or lengthened it (cyclopamine) and, consequently, altered the production of bipolar cells (less cells are generated if the cycle is long, and vice versa). Iobtained a list of 18 miRNAs that are highly expressed in the retina, differentially expressed in the samples and specifically more concentrated in those with a short, or S-phase blocked, cell cycle and vice versa. This list was reduced using an in silico analysis to find putative targets for all the included miRNAs on the 3'UTR of vsx1 and otx2. The final result was a list of 4 miRNAs, namely mir-129, mir-155, mir-222 and mir-214, which are candidates to the role of translational inhibitors of the bipolar cell fate.

I next validated the expression data obtained from the microarray, setting up and using a miRNA quantification protocol of real-time qRT-PCR. I therefore passed to analyze the spatial expression pattern of the candidate miRNAs through in-situ hybridization experiments on fully-developed retinal sections (embryonic stage 42) using modified locked nucleic acid (LNA) probes to increase specificity.
The expression of all the 4 candidate miRNAs appeared to be restricted to the ciliary marginal zone (CMZ), an area where undifferentiated retinal progenitors are present throughout adulthood, and partially in the earliest differentiated cell types (i.e. ganglion cells) that exited from the cell cycle soon before the expression of vsx1 and otx2. These data validated again the temporal expression profile already obtained.

Finally, I transfected into recipient cell lines (HEK 293 and HeLa) some plasmid sensors containing the green fluorescent protein (GFP), under a constitutive CMV promoter, bound upstream to the normal or mutated 3'UTR sequence of vsx1 and otx2. In fact, it has been shown that the normal 3'UTR is able to control GFP translation form such plasmid sensor, mimicking the expression of the gene it comes from. After transfecting individually the 4 miRNAs or their negative dominant (antisense 2'-O-methylated oligos) together with the sensors and an internal reference reporter coding for the red fluorescence protein, I quantified the GFP relative fluorescence level. I observed that the bipolar differentiation genes are indeed specifically inhibited by the candidate miRNAs for which a target was predicted by the in-silico analysis.
Other results, obtained within dr. Cremisi group, proved that the manipulation of miRNA expression levels can mime, or counteract, the previously described effects of cell cycle manipulation on the bipolar cells differentiation.

In conclusion, in this work, I proved that mir-129, mir-155, mir-222 and mir-214 are expressed in the Xenopus eye during the retinogenesis in proliferating neural progenitors, and are able to specifically inhibit the translation of the vsx1 and otx2 genes, preventing them from driving the cell to a bipolar fate. The results I obtained also suggest that the expression level of these miRNAs is proportional to cell cycle length, and that they could be a key component of the “molecular clock” which sets the birth date for retinal progenitors during time.
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