• base editing
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• ciglia
• cilia
• Discinesia Ciliare Primaria
• gene therapy
• nCas9
• nCas9
• Primary ciliary dyskinesia
• terapia genica

La Discinesia Ciliare Primaria (DCP) è una rara malattia genetica autosomica recessiva estremamente eterogena. Tale patologia è causata da mutazioni di geni che codificano per alcune componenti strutturali delle ciglia determinandone difetti funzionali. Questo a livello del tratto respiratorio si traduce principalmente in mancata clearance polmonare associata ad infezioni croniche e persistenti. Inoltre, un difetto nel movimento ciliare nella vita embrionale causa situs inversus e infertilità maschile. Ad oggi i principali approcci terapeutici utilizzati per il trattamento della DCP prevedono l’utilizzo della azitromicina al fine di cercare di mantenere un normale funzionamento degli organi delle vie aeree; tuttavia, ciò che manca è una cura per tale malattia. Dato che alcune delle mutazioni risultano essere a singolo nucleotide, un possibile approccio terapeutico potrebbe basarsi su una tecnica innovativa di gene-editing in grado di sostituire singoli nucleotidi, il base editing. Per l’applicazione di tale sistema è stato scelto il complesso formato dalla nickase Cas9 (nCas9) in unione con uno di due complessi enzimatici: la adenosina deaminasi (ABE) o la citidina deaminasi (CBE). La nCas9 deriva dal sistema CRISPR-Cas9, ma a differenza di quest’ultimo, essa esegue un taglio sul DNA a singolo filamento, mentre i due complessi enzimatici operano un cambiamento di base da adenosina a guanosina, nel caso di ABE, o da citosina a timina, nel caso di CBE. Per il trasporto a livello della mucosa respiratoria, abbiamo utilizzato vettori adeno-associati pseudotipizzati con un capside chimerico a maggiore tropismo per il tessuto bersaglio. Questi vettori, di facile produzione ad alto titolo e non integranti, sono stati ritenuti i più adatti per correggere le mutazioni associate a DCP.
Il presente lavoro di tesi ha lo scopo di validare e testare vettori AAV costruiti in modo da ripristinare le sequenze wild-type di geni associati a DCP. A tal fine è stata eseguita una prima fase di screening sui pazienti trattabili, selezionando 3 possibili candidati. Per ognuno di essi sono state disegnate le guide a RNA per indirizzare il sistema a livello del sito target e poi clonate nei rispettivi vettori come sequenze a doppio filamento di DNA (dsDNA).
È stata dimostrata l’effettiva formazione del complesso Cas9/ABE mediante trasfezione delle HEK293T ed esecuzione del Western Blot. I vettori AAV sono stati prodotti e titolati in collaborazione con l’istituto ICGEB di TriesteSono stati eseguiti gli esperimenti sulle cellule prelevate mediante brushing nasale dai pazienti. È stata valutata l’efficienza di trasduzione sugli sferoidi di pazienti tramite l’utilizzo di AAV-EGFP al microscopio confocale. Successivamente, è stata valuatata l’ efficacia del trattamento sia visivamente, osservando il recupero funzionale delle ciglia ed il ripristino della frequenza del battito ciliare corretto, sia geneticamente, effettuando la Solid Digital PCR (sdPCR) e la Droplet Digital PCR (ddPCR).È stato possibile effettuare il trattamento solo su 2 dei 4 pazienti selezionati, in quanto uno di essi proprio a causa della DCP presentava cellule fortemente contaminate da Klebsiella pneumoniae, mentre un altro non si è sottoposto alla procedura del brushing nasale. In conclusione, dall’analisi dei due pazienti trattati è emerso che il sistema è stato in grado di revertire la mutazione nel gene target e di conseguenza ripristinare il corretto funzionamento delle ciglia in uno dei due pazienti . Tali risultati aprono alla possibilità di ulteriori studi su questo approccio terapeutico per la cura della DCP.


Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a rare autosomal recessive genetic disorder that is extremely heterogeneous. This disease is caused by mutations in genes that code for certain structural components of the cilia, resulting in functional defects. This at the level of the respiratory tract mainly results in a lack of lung clearance associated with chronic and persistent infections. Furthermore, a defect in ciliary movement in embryonic life causes situs inversus and male infertility. To date, the main therapeutic approaches used for the treatment of DCP involve the use of azithromycin to try to maintain normal function of the airway organs; however, what is lacking is a cure for this disease. Since some of the mutations turn out to be single nucleotides, a possible therapeutic approach could be based on an innovative gene-editing technique capable of replacing single nucleotides, base editing. For the application of such a system, the complex formed by nickase Cas9 (nCas9) in combination with one of two enzyme complexes: adenosine deaminase (ABE) or cytidine deaminase (CBE) was chosen. The nCas9 is derived from the CRISPR-Cas9 system, but unlike the latter, it performs a cut on the single-stranded DNA, whereas the two enzyme complexes perform a base change from adenosine to guanosine, in the case of ABE, or from cytosine to thymine, in the case of CBE. For transport at the level of the respiratory mucosa, we used pseudotyped adeno-associated vectors with a chimeric capsid with increased tropism for the target tissue. These vectors, which are easily produced at high titre and non-integrating, were found to be the most suitable for correcting DCP-associated mutations.
The aim of this thesis work is to validate and test AAV vectors constructed to restore wild-type sequences of DCP-associated genes. To this end, an initial screening phase was carried out on treatable patients, selecting 3 possible candidates. For each of them, RNA guides were designed to direct the system to the target site and then cloned into the respective vectors as double-stranded DNA (dsDNA) sequences.
The effective formation of the Cas9/ABE complex was demonstrated by transfecting the HEK293Ts and performing Western blot. AAV vectors were produced and titrated in collaboration with the ICGEB institute in TriesteExperiments were performed on cells taken by nasal brushing from patients. The transduction efficiency on patient spheroids was evaluated using AAV-EGFP under confocal microscopy.The efficacy of the treatment was then assessed both visually, by observing the functional recovery of the cilia and the restoration of the correct ciliary beat frequency, and genetically, by performing Solid Digital PCR (sdPCR) and Droplet Digital PCR (ddPCR). It was only possible to treat two of the four selected patients, as one of them had cells heavily contaminated with Klebsiella pneumoniae as a result of the DCP, and another did not undergo the nasal brushing procedure. In conclusion, the analysis of the two treated patients showed that the system was able to reverse the mutation in the target gene and consequently restore the correct function of the cilia in one of the two patients . These results open up the possibility of further studies on this therapeutic approach for the treatment of DCP.