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Thesis etd-06222022-185320


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
AMBROSINI NOBILI, ARIANNA
URN
etd-06222022-185320
Thesis title
Caratterizzazione di un modello cellulare in vitro per lo studio dell'influenza dell'Apolipoproteina E4 nella malattia di Alzheimer
Department
FARMACIA
Course of study
FARMACIA
Supervisors
relatore Prof.ssa Daniele, Simona
relatore Dott.ssa Piccarducci, Rebecca
Keywords
  • neuroni colinergici
  • apolipoproteina E
  • malattie neurodegenerative
  • modelli cellulari
  • malattia di Alzheimer
Graduation session start date
13/07/2022
Availability
Withheld
Release date
13/07/2092
Summary
La malattia di Alzheimer (Alzheimer’s Disease, AD) è una patologia neurodegenerativa che gradualmente e inevitabilmente porta a un declino delle funzioni cognitive e mnemoniche. Nonostante siano stati individuati i segni patologici della malattia, quali l’aggregazione del frammento tossico della proteina β-amiloide (Aβ42) in placche amiloidi, l’aggregazione della proteina iperfosforilata tau (p-tau) e una perdita inarrestabile della trasmissione colinergica, ad oggi esistono solo terapie volte a rallentare la progressione neurodegenerativa e non a trattare definitivamente la patologia. Ciò ha permesso di dedurre l’esistenza di un quadro molto più complesso dei pathways patologici che intervengono nell’insorgenza e nell’avanzamento della malattia di Alzheimer. Tra i possibili meccanismi correlati alla patologia, l’allele ε4, una variante del gene codificante per l’apolipoproteina-E (Apolipotrotein-E, ApoE), è stato identificato come principale fattore di rischio per la malattia di Alzheimer: i portatori eterozigoti dell’allele ε4 hanno una probabilità maggiore di sviluppare la malattia di circa 3-4 volte rispetto ai soggetti non portatori dell’allele; negli omozigoti questa probabilità può invece incrementare fino a 9-15 volte. ApoE è una proteina espressa sia livello periferico che centrale ed è coinvolta nell’omeostasi del colesterolo: le apolipoproteine, avendo una forte affinità per i lipidi, sono capaci di aggregarsi in lipoproteine e permettere la veicolazione dei grassi all’interno dell’organismo. A livello centrale, oltre al suo ruolo fondamentale nel trasporto del colesterolo, ApoE garantisce un corretto sviluppo delle funzioni celebrali e tutela l’integrità tessutale a seguito di un danno: un suo scorretto funzionamento può condurre a delle conseguenze devastanti per la riparazione cellulare, l’integrità sinaptica e la clearance di agenti lipofili nocivi. Il gene codificante per ApoE presenta tre varianti alleliche, ε2, ε3 e ε4, codificanti per tre diverse isoforme proteiche, le quali presentano una differente struttura determinata da due diversi amminoacidi presenti in posizione 112 e 158 della sequenza amminoacidica; l’isoforma ApoE ε4 presenta una struttura instabile e una notevole riduzione della funzionalità proteica. In particolare, ApoE ε4 sembrerebbe ridurre la clearance della proteina Aβ e contemporaneamente aumentare la sua biosintesi, trasportare una minor quantità di colesterolo impedendo una corretta riparazione cellulare e favorire tutta una serie di pathways che contribuirebbero all’innesco della malattia di Alzheimer. Definire più accuratamente il quadro patologico innescato dell’allele ε4 e dalla relativa isoforma proteica ApoE ε4, permetterebbe lo studio di nuovi agenti farmacologici potenzialmente efficaci nella malattia di Alzheimer. Tuttavia, lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici è limitato dalla difficoltà dei modelli sperimentali di non riuscire a rappresentare adeguatamente il quadro patologico della malattia: i modelli in vivo sull’animale non simulano accuratamente i pathways patologici umani, mentre i modelli in vitro non replicano la complessità di un organismo. Tra i modelli in vitro, particolar attenzione è stata posta sui modelli 3D per la loro capacità di ricreare dei piccoli organoidi umani a partire da cellule staminali pluripotenti indotte; nonostante le potenzialità degli organoidi 3D, questi modelli sono altamente costosi e ancora in fase di perfezionamento. Per superare questi limiti, uno studio condotto di recente ha scoperto la possibilità di differenziare le cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y in simil neuroni colinergici tramite trattamento con acido retinoico e successivamente con il fattore neurotrofico cerebrale (Brain Derived Neurotrophic Factor, BDNF). A seguito del differenziamento, le cellule sono capaci di esprimere markers neuronali e colinergici sovrapponibili con i neuroni colpiti durante la malattia; le cellule SH-SY5Y differenziate possono essere poi trattate con oligonucleotidi Aβ tossici o trasfettate con geni correlati alla malattia di Alzheimer allo scopo di ricreare i pathways patologici della malattia. Le cellule SH-SY5Y differenziate tramite acido retinoico e BDNF presentano sempre lo svantaggio di non replicare la complessità di un organo, ma possono essere un ottimo candidato per condurre studi pilota in vitro. Lo scopo di questo lavoro di tesi consiste nel caratterizzare un modello cellulare in vitro per studiare l’influenza di ApoE ε4 nel modulare i pathways patologici della malattia di Alzheimer. A tal proposito, sono state utilizzate le cellule SH-SY5Y differenziate con acido retinoico e BDNF e successivamente trasfettate con un plasmide pCMV4-ApoE ε4, in modo che sovra-esprimessero l’isoforma patologica ApoE ε4. Parallelamente, la medesima linea cellulare differenziata è stata trasfettata con un plasmide pCMV4-ApoE ε3 come controllo interno. Alla fine del protocollo di differenziamento e trasfezione, sono state ricercate e quantificate alcune proteine tramite la tecnica del Western Blot, in modo da caratterizzare il modello in vitro: la proteina ApoE per verificare la sua espressione, l’enzima Colina acetil-transferasi (Choline Acetyltranferase, ChAT) come marker del fenotipo colinergico e le proteine Aβ e APP (Amyloid Precursor Protein) per analizzare la modulazione di ApoE ε4 sul pathway amiloidogenico caratteristico della malattia di Alzheimer. Successivamente, i dati ottenuti dalle cellule SH-SY5Y differenziate e trasfettate con il plasmide pCMV4-ApoE ε4 sono stati confrontati con i risultati ottenuti dal controllo, in modo da valutare l’attività patologica di ApoE ε4 rispetto a ApoE ε3. L’esito dello studio ha dimostrato che le cellule SH-SY5Y differenziate con acido retinoico e BDNF e trasfettate con il plasmide pCMV4-ApoE ε4 esprimevano sia i markers del fenotipo colinergico che la proteina ApoE ε4, presentando al contempo una maggior produzione di proteina Aβ e APP rispetto al controllo interno. In conclusione, questo studio ha dimostrato la possibilità di poter sviluppare un modello sperimentale in vitro al fine di studiare l’influenza di ApoE ε4 sui meccanismi patologici caratteristici della malattia di Alzheimer, con una possibile applicabilità futura soprattutto in termini di screening di nuovi composti naturali e/o di sintesi in studi pilota per l’individuazione di nuovi approcci terapeutici per la malattia.
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