• Bacillus cereus
• gut microbiota
• in vitro model
• microbiota intestinale
• modello in vitro

Il microbiota intestinale, per la sua complessità biologica e funzionale, è oggetto di un sempre maggiore interesse da parte della comunità scientifica. A causa della mutuale simbiosi che sussiste tra il microbiota e il suo ospite, è stato dimostrato che condizioni di disbiosi intestinale possono essere associate a numerosi processi patologici nell’uomo, non solo a localizzazione gastroenterica. Conoscere la precisa composizione della comunità microbica residente in condizioni sia di salute che di dismicrobismo è, quindi, diventato fondamentale, per prevenire o intervenire su determinati stati infettivi o patologici.
Sfruttando un nuovo sistema di coltivazione del microbiota intestinale basato sull’impiego di membrane in gelatina elettrofilate come supporto per la crescita microbica, questo elaborato di tesi si è posto l’obiettivo di analizzare la risposta adattativa del microbiota coltivato in vitro in presenza e in assenza di mucine, un’importante componente dell’ambiente intestinale, e di valutare gli effetti sulla composizione del microbiota dell’aggiunta del patogeno enterico Bacillus cereus.
Nella prima parte del progetto, il microbiota fecale derivato da un donatore sano è stato coltivato in presenza e in assenza di mucine. A intervalli di tempo stabiliti, sono stati condotti studi di osservazione al microscopio elettronico a scansione, di valutazione della vitalità tramite live/dead imaging, e di quantificazione della biomassa adesa agli scaffolds per verificare l’effetto delle mucine sull’adesione e sulla vitalità batterica.
Complessivamente, questi saggi hanno dimostrato che il microbiota è in grado di sfruttare le membrane di gelatina come supporto alla propria crescita e che la comunità batterica si organizza in un biofilm progressivamente sempre più stabile e complesso. La presenza delle mucine sulle membrane elettrofilate, sorprendentemente, sembra peggiorare l’adesione e la crescita della comunità batterica in vitro. La capacità di formare biofilm è stata valutata anche inserendo nella coltura in vitro un ceppo patogeno di Bacillus cereus o il suo sovranatante di coltura. In questo caso, i risultati ottenuti hanno permesso di dimostrare che la presenza del patogeno riduce significativamente la quantità di biomassa adesa agli scaffolds, sia in presenza che in assenza di mucine.
Successivamente, sono state condotte analisi in Real-Time qPCR e metagenomica per determinare, rispettivamente, le variazioni quantitative e qualitative nella composizione del microbiota successive alla perturbazione con B. cereus. Tutti i phyla presenti nel campione fecale rimangono numericamente stabili con la coltivazione in vitro, sia in presenza che in assenza di mucine, ad eccezione del phylum Proteobacteria di cui è stato evidenziato un aumento significativo sin dalle prime 24 h di incubazione. B. cereus e il suo sovranatante di coltura si sono rivelati in grado di ridurre l’espansione smodata di tale phylum, oltre a causare variazioni quantitative in altri phyla. Come dimostrato dai risultati dell’analisi metagenomica, anche l’abbondanza relativa di alcuni generi batterici varia in modo marcato in presenza di B. cereus o del suo sovranatante di coltura.
In conclusione, poiché le complesse interazioni che si stabiliscono tra i membri della popolazione microbica intestinale sono difficili da indagare in vivo e la necessità di traslare gli studi in vitro si è fatta sempre più pressante, il modello di coltura in vitro impiegato nel presente progetto si è dimostrato una valida alternativa per condurre tali indagini e per valutare gli effetti di una perturbazione sulla composizione del microbiota intestinale, muovendo un passo verso la costruzione di sistemi più avanzati per gli studi del microbiota umano in vitro.