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Riassunto
Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore raro e aggressivo che prende origine dal mesotelio pleurico, una membrana sierosa che riveste i polmoni e la parete interna del torace. Il MPM è principalmente causato da esposizione ad amianto (o asbesto). Il lungo periodo di latenza che intercorre tra l’esposizione alle fibre di asbesto e la comparsa dei primi sintomi (circa 40 anni), la mancanza di tecniche diagnostiche efficaci e poco invasive, e una scarsa specificità dei sintomi iniziali, risultano spesso in una diagnosi tardiva. Le opzioni terapeutiche variano dalla chirurgia alla chemio- e radioterapia; tuttavia, risultano poco efficaci. Per superare questo problema molti studi si stanno concentrando sulla valutazione di diversi target molecolari in grado di favorire diagnosi più precoci e nuove azioni terapeutiche. Fra i potenziali target, finora identificati, è presente la mesotelina (MSLN), una proteina di membrana espressa a livelli basali da cellule di origine mesoteliale, ma che viene sovraespressa in alcuni tumori, incluso il MPM. Il ruolo della MSLN in condizioni fisiologiche ancora non è chiaro: topi knock-out per il gene MSLN risultano vitali. Al contrario, nelle cellule tumorali, MSLN sembra ricoprire un ruolo importante: è infatti coinvolta nella progressione, sopravvivenza, proliferazione e invasione tumorale. Sulla base di queste osservazioni sono stati sviluppati anticorpi monoclonali che hanno come target la MSLN. Nonostante i risultati incoraggianti di alcuni trial clinici, le dimensioni degli anticorpi (~150 KDa) rappresentano un fattore limitante in quanto ne riducono la penetrazione nei tessuti tumorali densi, e ne limitano l’efficacia terapeutica. Per superare questi limiti sono state recentemente ingegnerizzate varianti di fibronectina III (FN3), piccoli scaffold proteici non anticorpali dal peso di 15 KDa, caratterizzati da un’elevata affinità per la MSLN. Studi preliminari hanno rilevato l’internalizzazione selettiva di FN3 da parte di cellule esprimenti MSLN, spostando dunque l’attenzione su FN3 e sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che ne prevedano l’utilizzo come trasportatore di farmaci o molecole con azione citotossica per il trattamento di MPM. Lo scopo di questo lavoro è quello di coniugare FN3 con diversi radioisotopi per sviluppare un nuovo approccio terapeutico personalizzato per pazienti affetti da MPM e il loro follow-up. Una variante di FN3 è stata fatta esprimere in cellule di E. coli (BL21, DE3), estratta con cicli di shock termico e poi purificata tramite cromatografia su colonna. Una linea cellulare di MPM (MSTO-211H) è stata ingegnerizzata per esprimere alti livelli di MSLN. Cloni stabili di questa linea sono stati selezionati tramite fluorescence-activated cell sorting (FACS), e utilizzati per valutare il legame tra FN3 e MSLN. Un’ulteriore conferma del legame tra le due proteine è stata ottenuta tramite immunofluorescenza. Infine, per valutare che la marcatura di FN3 con molecole chelanti non influisse negativamente sulla sua affinità di legame con MSLN, sono stati condotti esperimenti analoghi in citofluorimetria e immunofluorescenza utilizzando FN3 coniugata con DOTA-GA.


Abstract
Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive cancer that arises from the pleural mesothelium, a serous membrane that lines the lungs and inner chest wall. MPM is mainly caused by exposure to asbestos. The long latency between asbestos exposure and the onset of the disease (about 40 years), the lack of adequate and minimally invasive diagnostic techniques, and the limited specificity of the initial symptoms often result in a late diagnosis. Therapeutic options vary from surgery to chemo- and radiotherapy; however, they are not very effective. To overcome this problem, many studies are focusing on the evaluation of different molecular targets to exploit for early diagnosis and new therapeutic approaches. Among the potential targets identified so far is mesothelin (MSLN), a membrane protein expressed at basal levels by cells of mesothelial origin but overexpressed in some tumors, including MPM. The physiological role of MSLN still needs to be fully understood, with knock-out mice for the MSLN gene showing a normal phenotype. On the contrary, MSLN plays an important role in tumor cells, being involved in tumor progression, survival, proliferation, and invasion. Based on these observations, monoclonal antibodies targeting MSLN have been developed. Despite the encouraging results of some clinical trials, the size of the antibodies (~150 KDa) represents a limiting factor as it reduces their penetration into dense tumor tissue and limits their therapeutic efficacy. To overcome these limitations, a small non-antibody scaffold (15 kDa) based on fibronectin III (FN3) has been recently engineered to bind MSLN. Preliminary studies have found the selective internalization of FN3 by MSLN-expressing cells, thus shifting the attention to FN3 as a possible carrier of cytotoxic molecules for therapeutic purposes in MPM and other MSLN overexpressing cancers. This work aims to combine FN3 with different radioisotopes to develop a new personalized therapeutic approach for MPM patients and their follow-up. A variant of FN3 was expressed in E. coli cells (BL21, DE3), extracted with cycles of heat shock, and then purified by affinity chromatography. An MPM cell line (MSTO-211H) was engineered to express high levels of MSLN. Stable clones of this line were selected by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and used to evaluate the binding affinity between FN3 and MSLN. Further confirmation of the binding between the two proteins was obtained by immunofluorescence. Finally, to evaluate that labeling FN3 with chelating molecules does not negatively affect its binding affinity with MSLN, similar experiments were performed in flow cytometry and immunofluorescence using DOTA-GA conjugated FN3.