• Modulatori recettore CB2

Il Sistema Endocannabinoide (ECS), è uno dei principali sistemi neuromodulatori endogeni del nostro organismo ed è implicato nel controllo di molte condizioni fisiologiche e patologiche . Esso è composto dai recettori cannabinoidi (CBRs, CB₁R e CB₂R), dai ligandi endogeni dei recettori cannabinoidi, noti come endocannabinoidi (ECs), tra i quali figurano principalmente l’anandamide (AEA) e il 2-arachidonoil-glicerolo (2-AG), e dagli enzimi deputati all’attivazione, alla degradazione (FAAH, MAGL, ABHD6, ABHD12) e al trasporto (EMT) degli endocannabinoidi. I CBRs appartengono alla grande famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e sono ampiamente distribuiti nel nostro organismo. I CB₁R sono maggiormente presenti a livello del sistema nervoso centrale, mentre i CB₂R sono presenti principalmente a livello periferico, in particolare nelle cellule associate al sistema immunitario, dove modulano la migrazione cellulare e il rilascio di citochine . Studi recenti hanno dimostrato inoltre la presenza dei CB₂R anche in alcune aree del sistema nervoso centrale, in particolar modo a livello della microglia. Per la loro estesa localizzazione e per il ruolo fondamentale che la modulazione dei recettori cannabinoidi può svolgere nel trattamento di diverse patologie, fra cui malattie neurodegenerative, epilessia, dolore neuropatico, disordini del comportamento, stati ansiosi, aterosclerosi, disordini metabolici e cancro, è nato un grande interesse per l’identificazione e la caratterizzazione di ligandi ortosterici dei CBRs . Tuttavia, l’impiego terapeutico di agonisti CBRs è associato a numerosi effetti collaterali (ad esempio, effetti psicoattivi, ansia, depressione o disfunzioni immunitarie) che hanno fortemente limitato la loro utilità clinica. Ciò ha stimolato la ricerca di piccole molecole caratterizzate da modalità alternative di modulazione dei CBRs. In questo contesto, particolare attenzione è stata rivolta ai modulatori allosterici, molecole in grado di legarsi ad un sito topograficamente e strutturalmente distinto da quello ortosterico, e capaci di provocare un cambiamento conformazionale del recettore che a sua volta influenzerà l’affinità e/o l’efficacia del ligando ortosterico per il recettore stesso . I modulatori allosterici sono in grado di aumentare o diminuire l’affinità di legame e/o l’attività funzionale di un certo recettore e possono essere definiti rispettivamente PAM (modulatori allosterici positivi) o NAM (modulatori allosterici negatici). Questi si distinguono inoltre dai modulatori allosterici silenti (SAM), che invece non modulano l’affinità per il recettore o la sua funzionalità, ma competono piuttosto con un PAM o un NAM sul sito allosterico. Il grande interesse per i modulatori allosterici è incentivato dai molti vantaggi che offrono, tra cui spiccano l’elevata specificità per il sottotipo recettoriale (a causa della maggiore divergenza di sequenze extracellulari nei siti allosterici rispetto a quelli ortosterici); selettività tissutale (esercitano il loro effetto solo dove sono presenti i ligandi endogeni); saturabilità d’effetto; “signalling” preferenziale e “probe”-dipendenza, ovvero la capacità di attivare selettivamente certe vie di segnale rispetto ad altre, anche a seconda del ligando ortosterico che interagisce con il recettore.
Nel laboratorio presso il quale ho svolto la mia attività di tesi è stato sintetizzato il primo PAM del CB₂R, EC21a, il cui profilo allosterico è stato identificato mediante studi di binding e studi funzionali . I saggi di binding hanno mostrato un aumento dell’affinità di legame sul CB₂R dell’agonista ortosterico di riferimento [3H] CP55940. Successivamente, i saggi funzionali effettuati su GTPγS, cAMP e β-arrestina, hanno messo in evidenza la capacità di EC21a di aumentare l’attività del CP55940 e, nel caso specifico del GTPγS, anche del 2-AG ma non dell’AEA. Al contempo, i medesimi saggi funzionali condotti in assenza del ligando endogeno di riferimento, non hanno mostrato alcuna attività da parte di EC21a confermandone così la natura di PAM. EC21a ha mostrato inoltre promettenti risultati nei test in vivo, condotti sia su un modello murino di dolore neuropatico, rivelando una notevole attività antinocicettiva , che su un modello di epilessia, mostrando un’importante azione anticonvulsivante .
Durante il mio periodo di tesi, mi sono occupata della sintesi di nuovi derivati dell’EC21a, composti A1-A4, al fine di ampliare le conoscenze riguardo le relazioni struttura-attività (SAR) di questa classe di composti. Precedenti modifiche strutturali riguardanti il sostituente p-fluoro benzilico sulla posizione 1 dell’anello centrale, hanno evidenziato come la presenza di un atomo di fluoro o di cloro in posizione 2’ e la contemporanea assenza dell’atomo di fluoro in 4’, fosse favorevole per l’attività allosterica sul CB2R.
Sulla scia dei risultati ottenuti con i precedenti studi SAR, durante il mio lavoro di tesi mi sono focalizzata sull’inserimento di diversi alogeni (Cl, F, I e Br) a livello del sostituente benzilico in posizione N-1. In un primo momento, mi sono incentrata sulla sintesi dei derivati mono-sostituiti A1-A2, caratterizzati dall’assenza dell’atomo di fluoro in 4’ e dalla presenza degli atomi di iodio o bromo in posizione 2’ del sostituente benzilico, al fine di completare la serie dei 2’-alo derivati precedentemente iniziata. In un secondo momento, ho invece sintetizzato i derivati di-sostituiti A3-A4, inserendo sulla porzione 4’-fluoro benzilica dell’EC21a, gli atomi di fluoro o di cloro in posizione 2’ che avevano portato a risultati promettenti negli studi precedenti.
I composti A1-A4 verranno testati presso l’Università di Saskatchewan, nel laboratorio del Dr. Laprairie con opportuni saggi sia di binding che funzionali, allo scopo di valutare il loro profilo allosterico.