• emofilia acquisita
• fattore VIII
• isotipo anticorpale
• test Bethesda
• test ELISA

Il fattore VIII è un cofattore non enzimatico del fattore IXa, facente parte del complesso Tenasico, complesso fondamentale nella formazione di fattore X attivato, nella via intrinseca della coagulazione. La carenza di tale fattore riduce la generazione di trombina sulla superfice delle piastrine attivate. L’emofilia A acquisita è una malattia emorragica rara, causata dallo sviluppo di autoanticorpi contro il fattore VIII, che interferiscono con la sua funzione coagulante. Tali autoanticorpi sono di origine policlonale, non precipitanti e legano il fattore VIII in modo dipendente dal tempo e dalla temperatura. Anticorpi inibenti il fattore VIII possono insorgere spontaneamente in seguito a disordini immunologici, dopo il parto o in seguito a neoplasie. La maggior parte degli autoanticorpi lega i domini A2, A3 eC2 del fattore VIII. Gli anticorpi anti C2 interferiscono nell’interazione tra il fattore VIII e i fosfolipidi, mentre gli anticorpi anti A2 e A3 interferiscono con il legame del fattore VIII con il fattore X e al IX attivato. I pazienti che sviluppano tali inibitori acquisiti possono presentare episodi di sanguinamento nonostante non abbiano mai avuto precedentemente disturbi emorragici. La tipizzazione di tali inibitori ha una certa rilevanza dal punto di vista prognostico, in quanto i pazienti provvisti di autoanticorpi anti-fattore VIII appartenenti alla classe IgA hanno ottenuto una remissione completa meno frequentemente rispetto a pazienti provvisti di autoanticorpi di classe differente. Capire quale isotipo anticorpale è responsabile dell’emofilia acquisita in un certo paziente è quindi utile al fine di personalizzare il trattamento immunosoppressivo. Lo scopo della tesi è perciò quello di sviluppare un test ELISA di tipo indiretto per la discriminazione dell’isotipo dell’anticorpo contro il fattore VIII che si sviluppa in corso di emofilia A acquisita. Per la realizzazione del test ELISA ci siamo serviti di due campioni di plasma per ognuno dei pazienti in esame. Il primo campione è plasma risultato positivo alla presenza di autoanticorpi contro il fattore VIII, mentre il secondo è plasma risultato negativo in seguito a trattamento immunosoppressivo. È stato utilizzato anche un terzo campione, contenente plasma appartenente ad un pool di soggetti normali che non hanno mai espresso un anticorpo inibente il fattore VIII. Il test ELISA è stato allestito utilizzando una micropiastra da novantasei pozzetti. Il fondo dei pozzetti è stato ricoperto da un concentrato di fattore VIII stabilizzato dal fattore di Von Willebrand. Successivamente è stato aggiunto il plasma. In presenza di autoanticorpi diretti contro il fattore VIII ci sarà una interazione fattore-anticorpo che sarà rilevata in seguito dopo l’aggiunta dell’anticorpo secondario marcato con l’enzima fosfatasi alcalina. Per dimostrare la presenza di un particolare isotipo anticorpale nel plasma del paziente sono stati utilizzati anticorpi secondari anti-immunoglobuline IgA o anticorpi secondari antiimmunoglobuline IgG. Dopo l’aggiunta del substrato specifico per l’enzima fosfatasi alcalina, nel caso in cui la reazione è positiva (presenza degli anticorpi ricercati) esso sarà trasformato in un prodotto colorato. L’intensità della colorazione è proporzionale alla quantità di enzima presente e dunque alla concentrazione dell’anticorpo ricercato. L’interpretazione dei risultati è stata eseguita misurando la densità ottica a 405 nm, utilizzando un lettore di micropiastre.