• Transtiretina
• Amiloidosi
• TTR

Le amiloidosi sono un gruppo di patologie conosciute come malattie da misfolding proteico, causate dalla anormale deposizione di fibrille proteiche insolubili chiamate amiloidi. La diagnosi dell'amiloidosi richiede l'identificazione dei depositi di amiloidi tramite specifica colorazione con Rosso Congo (1).
In questa tesi ho approfondito le amiloidosi sostenute dal misfolding della proteina Transtiretina ATTR.
La transtiretina (TTR) è una proteina plasmatica coinvolta nel trasporto della tiroxina (T4) nel plasma e nel fluido cerebrospinale e del retinolo mediante il suo legame con una proteina chaperon retinol binding protein (RBP). Il suo acronimo TTR Transports Thyroxine and Retinol è legato al suo ruolo di proteina trasportatrice. La TTR è sintetizzata principalmente nel fegato, nel plesso coroideo del cervello, in minor quantità nella retina , nella placenta, essa è presente sia nel plasma umano che nel liquido cerebro spinale (CSF), a differenti concentrazioni (2,3).
Da un punto di vista chimico, la TTR è una proteina di 55 kDa composta da quattro monomeri identici ciascuno formato da 127 aminoacidi, ricchi di subunità a beta foglietto. I monomeri, chiamati A B C e D non sono legati covalentemente ed hanno struttura a beta sandwich composta da due foglietti β antiparalleli, ognuno dei quali formato a sua volta da quattro filamenti β. La struttura quaternaria della TTR include due siti di legame per la tiroxina, presente all’interfaccia dimero dimero (A,B/C,D). Ogni sito di legame della T4 avente forma ad imbuto è caratterizzato da 2 sottositi simmetrici formati da una piccola tasca interna (inner binding pocket) ed una grande tasca esterna (outer binding pocket). Nei sottositi, sono presenti 3 duplici depressioni, chiamate tasche di legame per alogeni o Halogen Binding Pocket (HBPs1, HBPs2, HBPs3), capaci di accomodare gli atomi di iodio del ligando naturale (T4).
La TTR circola normalmente come una proteina solubile, ma in alcuni individui, per cause ancora non conosciute, sia la forma nativa che le forme mutate formano delle fibrille amiloidi insolubili che si depositano in vari organi dando origine a gravi e rare patologie denominate amiloidosi da TTR o ATTR. Queste possono essere divise in quattro tipi:
• Amiloidosi Familiare Polineuropatica (FAP)
• Amiliodosi Familiare Cardiomiopatica (FAC)
• Amiloidosi del Sistema Nervoso Centrale (CNSA)
• Amiloidosi Sistemica Senile (SSA)
Le prime due sono di tipo ereditario, dovute a mutazioni a carico della transtiretina, come la Val30Met nella FAP e la V122I nella FAC4.
La FAP è caratterizzata da una neuro degenerazione sensoriale con alterazione della percezione del dolore e della temperatura, prima alle estremità degli arti fino ad arrivare al busto. Con il progredire della malattia il paziente sviluppa difficoltà nel camminare fino ad arrivare alla paralisi.
La FAC deriva dall'aggregazione e dalla deposizione della proteina mutata o di tipo nativo nel cuore, portando a disfunzione diastolica da cardiomiopatia restrittiva e insufficienza cardiaca.
Nella CNSA la TTR mutata porta alla deposizione delle fibre amiloidi nel fluido cerebrospinale. Le fibre amiloidi nel SNC possono favorire la comparsa di morbo di Alzheimer, Angiopatia amiloide cerebrale sporadica, sindrome di Down, Parkinson-demenza di Guam, emorragia cerebrale ereditaria con amiloidosi-tipo olandese e angiopatia amiloide asintomatica legata all'età (5).
La SSA è causata dalla TTR nativa (Wild Type TTR) non mutata, che in particolari condizioni che la rendono instabile e induce la formazione di fibrille amiloidi insolubili.
Le fibrille tendono a depositarsi nel cuore anche in organi sanguigni come le arterie, specialmente nell'aorta, dando problemi cardiaci come la fibrillazione atriale.
Per combattere le amiloidosi sono allo studio tre strategie terapeutiche:
• Inibizione della produzione e della secrezione della TTR
• Disgregazione delle fibrille formata.
• Stabilizzazione della struttura tertramerica della TTR
La strategia più usata per inibire la produzione di TTR è il trapianto ortotopico di fegato. Il fegato è il principale secretore di TTR, con il trapianto di un fegato sano si abolisce quindi gran parte della secrezione di TTR mutata. Tuttavia la terapia è invasiva e non risolve la produzione di TTR mutata in altri organi come nella retina o nel plesso coroideo del cervello.
Terapie emergenti come gli oligonucleotidi antisenso (ASO) e gli small interfering RNAs (siRNAs) mirano alla inibizione della produzione della TTR mutata senza gli effetti avversi del trapianto di fegato.
Per la disgregazione dei depositi amiloidi sono stati presi in considerazione due farmaci: la doxiciclina e l’acido biliare tauroursodesossicolico (TUDCA), attualmente in fase di sperimentazione clinica, hanno mostrato la capacità di ridurre i depositi tissutali di fibrille in test su topi transgenici con mutazioni amiloidogeniche della TTR.
Sono stati studiati anche anticorpi anti Serum Amyloid P (SAP). La SAP è una glicoproteina plasmatica presente nelle fibrille ed il suo effetto è la stabilizzazione delle fibrille e il rallentamento della loro degradazione e rimozione.
La stabilizzazione del tetramero è la strategia scelta dal gruppo di ricerca dove ho svolto la mia tesi che da tempo studiano questo tipo di strategia terapeutica. I composti in grado di stabilizzare la struttura tetramerica della TTR si possono dividere in due grandi gruppi: composti naturali come Resveratrolo, Curcunina, Genisteina ed Epigallocatechina Gallato e composti di sintesi come alcuni FANS, quali Diflunisal ed il derivato a struttura benzoassazolica, il Tafamidis6, questo ultimo nel 2019 è stato approvato per la FAP dall’FDA, unica agenzia che ancora non aveva approvato il suo uso in terapia.
In questa tesi ho affrontato la sintesi di composti analoghi dei FANS quali il diflunisal a struttura monoarilica di tipo A. Il gruppo arilico recante la funzione acida presente nel Diflunisal è stato sostituito da una porzione eteroatomica (CH2-O-N=CH) come nei composti di tipo B o da( CH2-O-N=CHCH3) come nei composti di tipo C
Inoltre sono stati sintetizzati i composti bisiarilici di tipo D quali analoghi del Resveratrolo. In questi composti è stata modificata la posizione o il numero di sostituenti ossidrilici presenti su un anello poliidrossilato del Resveratrolo. Sull’anello monoidrossi-sostituito del Resveratrolo il gruppo ossidrilico è stato sostituito con un atomo di fluoro in grado di dare legami ad idrogeno con gli AA presenti nel sito di legame e/o di interagire con le tasche lipofile delle HBPs. Anche nei derivati bisarilici il linker tra le due porzioni aromatiche è caratterizzato da una catena eteroatomica flessibile, che a differenza della porzione stilbenica rigida presente nel Resveratrolo permette una certa libertà di rotazione delle porzioni aromatiche che potrebbero favorire le interazioni dei gruppi funzionali con gli AA presenti nel sito attivo di legame nella TTR.
I composti sintetizzati saranno testati in saggi preliminari per valutare la loro capacità di inibire la formazione di fibrille amiloidi da transtiretina.

Bibliografia
1. Hassan W, Al-Sergani H, Mourad W, Tabbaa R, Amyloid heart disease. New frontiers and insights in pathophysiology, diagnosis, and management, in Tex Heart Inst J, vol. 32, nº 2, 2005, pp. 178–8
2. Ingbar, S.H. A thyroxine-binding protein of human plasma. Endocrinol., 1958, 63, 256-259
3. Kanai, M.; Raz, A. Goodman D. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest., 1968, 47, 2025-2044
4. Connors LH, Lim A, Prokaeva T, Roskens VA, Costello CE. Tabulation of human transthyretin (TTR) Variants, 2003; 10:160-184
5. Amyloid in central nervous system disease. J. Haan R.A.C. Roos
6. Klabunde T, Petrassi HM, Oza VB, Raman P, Kelly JW, Sacchettini JC. Rational design of potent human thrastyretin amyloid inhibitors. Nat. Struct. Biol., 7, 312-321 (2000).