• H9c2
• ingegneria tessutale cardiaca
• inkjet
• bioprinting
• stimolazione elettrica
• cardiopatia ischemica

Introduzione
A livello mondiale le malattie cardiovascolari rappresentano la principale causa di morte.
Nei casi di grave entità diventa necessario ricorrere a strategie di trattamento invasive quali il trapianto. Questa procedura è attualmente l'unica soluzione in grado di fornire un recupero pressoché totale della funzionalità cardiaca anche se l’esiguo numero di donatori rende la strada del trapianto di cuore difficilmente percorribile.
L’ingegneria tessutale cardiaca nasce dall’esigenza di voler superare queste limitazioni: questa ha l’obiettivo di creare un tessuto cardiaco ingegnerizzato servendosi di supporti detti scaffold, su cui è possibile far aderire, vivere e replicare cellule al fine di ottenere un tessuto funzionale.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è quello di ricostruire un modello in vitro (o sostituto funzionale) del tessuto cardiaco attraverso la fabbricazione di scaffold le cui proprietà elettriche conduttive possano essere sfruttare per stimolare colture cellulari cardiache. A tale scopo, gli scaffold sono stati seminati con cellule ventricolari di embrione di ratto (H9c2) con il fine di verificare il differenziamento cellulare indotto da una stimolazione di tipo elettrico e confrontarlo con un sistema di riferimento caratterizzato da stimolo di tipo chimico, tramite stimolazione con Acido Retinoico.
Materiali e metodi
Il lavoro di tesi ha previsto due fasi: la fabbricazione degli scaffold, con relativa caratterizzazione, e i test cellulari.
La fabbricazione ha previsto una fase preliminare di analisi di deposizione e di spessore delle linee di nanotubi di carbonio, stampate tramite Penelope Thermal Inkjet, alla concentrazione dello 0,3%(p/v) su uno strato di gelatina di tipo A alla concentrazione del 5%(p/v). La reticolazione è stata ottenuta con la deposizione della genipina ottenendo una concentrazione dell’1%(p/v). Le linee sono state fotografate al microscopio, processate con il software ImageJ, ed il loro spessore confrontato con la dimensione delle linee teoriche.
Si è proceduto alla fabbricazione di scaffold conduttivi di cui si è andati a valutare la conducibilità elettrica. Gli scaffold sono costituiti da una base di gelatina al 5%(p/v), con una griglia di nanotubi di carbonio (concentrazione 0,3%(p/v) e 0,6%(p/v)). Su questi due tipi di scaffold è stata effettuata la misurazione dell’impedenza, ponendoli in tre diverse condizioni: dry (campione secco), wet (campione reidratato) e medium (campione nel terreno di coltura).
Nell’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa si è proceduto con test cellulari degli scaffold. Le strutture sono state seminate con cellule H9c2 in terreno DMEM completo per un giorno e, si è proceduto a stimolazione elettrica tramite un sistema di copertura della piastra, munito di aghi in platino, e collegato ad un generatore di impulsi di corrente (frequenza 1Hz, intensità del campo elettrico 5V/cm, durata dell’impulso elettrico 2ms).
Come sistema di riferimento per il differenziamento cellulare, cellule su scaffold sono state poste in contatto con terreno di coltura addizionato con Acido Retinoico (50 nM) e FBS 1%. L’esperimento ha avuto una durata di 7 giorni.
Terminato l’esperimento, sono state effettuate analisi di immunoistochimica rivolte alla valutazione del citoscheletro e della miosina (MYL2) utile per evidenziare il grado di differenziamento delle cellule.
Risultati
Per quanto concerne la caratterizzazione delle linee di nanotubi di carbonio è stato osservato che le linee teoriche sono pari a circa 1/3 delle linee sperimentali. Questo dato ha permesso di poter compiere valutazioni pre-stampa adattando i parametri per adeguare il processo produttivo.
Valutando i valori d’impedenza per la caratterizzazione elettrica degli scaffold, è possibile affermare che al variare delle condizioni (dry, wet, medium), in cui si trova il campione, si hanno variazioni significative anche dell’impedenza e che le differenti concentrazioni di nanotubi di carbonio non influiscono sulla sua conducibilità elettrica ad eccezione del campione nella condizione dry. Inoltre è stato appurato che la conducibilità elettrica di scaffold inseriti in una soluzione di PBS, non subisce variazioni nel tempo.
Analizzando le curve di vitalità, ottenute dai test per la caratterizzazione biologica, si è evidenziata la biocompatibilità degli scaffold. La stimolazione elettrica non altera i valori di vitalità rispetto al controllo, come invece visibile con la somministrazione di Acido Retinoico: tale condizione può essere ascrivibile a fenomeni di differenziamento con conseguente passaggio delle cellule dallo stato proliferante ad uno quiescente. I saggi di immunoistochimica mostrano, per quanto riguarda la stimolazione elettrica, segni di modulazione della struttura citoscheletrica e di differenziamento cellulare, molto più evidenti nelle cellule in contatto con Acido Retinico.

Conclusioni
In questo lavoro di tesi, gli scaffold fabbricati con una concentrazione del 0,3%(p/v) CNTs non mostrano una conduttività statisticamente differente rispetto agli scaffold con una concentrazione del 0,6%(p/v) CNTs per cui, in accordo con i dati di citotossicità, sono stati scelti per la successiva caratterizzazione biologica con le cellule H9c2.
Per quanto concerne la caratterizzazione biologica, le cellule mostrano iniziali segni di differenziamento verso un fenotipo cardiaco, in risposta alle condizioni di coltura utilizzate.
Sebbene i risultati ottenuti siano preliminari, questo studio rappresenta un ulteriore passo nello sviluppo di scaffold conduttivi per applicazioni nell’Ingegneria dei Tessuti Cardiaci. Una più approfondita caratterizzazione biologica degli effetti di stimolazione elettrica permetteranno di ottenere ulteriori informazioni sulle modifiche fenotipiche indotte nelle cellule.