• Frazionamento di Cohn
• Plasma
• Proteasi

Durante il periodo di tesi svolto presso l’azienda Kedrion (azienda farmaceutica produttrice di farmaci plasma derivati) è stato sviluppato il metodo per quantificare l’attività proteolitica nei vari intermedi del frazionamento del plasma. Il frazionamento consiste nel processo di isolamento di proteine terapeutiche utili nella cura e trattamento di molte malattie a partire da plasma umano.
Le proteasi sono enzimi idrolitici coinvolti nella digestione proteica, in grado di rompere i legami peptidici che uniscono i vari amminoacidi.
L’attività delle proteasi è di vitale importanza per molte funzioni dell’organismo, ad esempio, svolgono un ruolo fondamentale nel processo della coagulazione del sangue. Di contro la concentrazione di proteasi deve essere monitorata sia durante il processo di frazionamento che nel prodotto finito. La presenza di proteasi nel prodotto finito può influenzare la stabilità e l’efficacia del prodotto stesso e rappresentare quindi un fattore limitante per la fruibilità del paziente finale.
In tale ottica, l’individuazione e la messa a punto di un test in grado di quantificare l’azione congiunta di una ampia famiglia di proteasi è di fondamentale importanza per monitorare la qualità del materiale lavorato durante tutto il processo di frazionamento, permettendo inoltre di approfondire la conoscenza dei vari step critici connessi con attivazione e rimozione dell’attività proteolitica stessa. La determinazione quantitativa dell’attività proteolitica totale nei campioni è stata effettuate mediante l’utilizzo di uno strumento automatizzato in grado di eseguire tra i vari test, anche analisi di tipo cromogenico: il coaugulometro ACL TOP 750.
Il substrato cromogenico utilizzato, S-2288, è sensibile verso un ampio spettro di serin-proteasi. Come possibile materiale di riferimento per la costruzione di una curva di calibrazione verso cui ricalcolare l’attività misurata nel campione è stato scelto l’attivatore tissutale del plasminogeno (t-PA). Nei sistemi purificati il t-PA idrolizza substrati cromogenici, rilasciando la p-nitroanilina. La formazione di pNA è determinata spettrofototometricamente a 405 nm con il coagulometro.
Intermedi rappresentativi delle principali fasi di frazionamento del plasma sono stati analizzati in modo da poter determinare l’attività protolitica attraverso l’analisi cinetica dell’incremento dell’assorbanza.